人眼脈絡膜黑色素細胞參與細胞外基質重塑機制的研究.pdf

1、目的：葡萄膜—鞏膜細胞外基質重塑機制在很多眼病研究中有重要意義，如前列腺素類藥物降眼壓機制、近視眼的形成機制等，都與眼局部信號轉導調控鞏膜基質重塑有關。研究脈絡膜黑色素細胞表達基質金屬蛋白酶的調控機制，及其對葡萄膜—鞏膜細胞外基質重塑過程的影響，可以更好地理解脈絡膜黑色素細胞在眼球生長調控中參與局部信號轉導的作用機制。本研究的目的是利用體外培養(yǎng)人眼脈絡膜黑色素細胞，選擇與葡萄膜—鞏膜細胞外基質重塑有關的兩種因子：前列腺素F2α與轉化生長

2、因子β2作為刺激因子，觀察黑色素細胞表達基質金屬蛋白酶及其抑制劑的變化。這個機制不但可以幫助我們更好地理解前列腺素F2α類藥物降低眼壓的機制，還有助于探索近視形成過程中，轉化生長因子β2調控細胞外基質重塑的過程。 材料和方法： 1.將人新鮮尸眼的脈絡膜組織用胰蛋白酶與膠原酶多次消化，分離得到的細胞用添加胎牛血清、堿性成纖維細胞生長因子、異丁基甲基黃嘌呤、霍亂毒素的F12培養(yǎng)液進行培養(yǎng)、傳代、凍存和復蘇。用透射電鏡、細胞免

3、疫化學染色鑒定細胞性質。 2.將體外培養(yǎng)的人眼脈絡膜黑色素細胞隨機分為對照組、前列腺素F2α組、轉化生長因子β2組。前列腺素F2α組的加入濃度分別為0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml，轉化生長因子β2組的加入濃度分別為0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml。使用倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)，細胞計數(shù)法和MTT法分別測定各組細胞的數(shù)目與活性。 3.將體外培養(yǎng)的人眼脈絡膜黑

4、色素細胞隨機分為對照組、前列腺素F2α組、轉化生長因子β2組，前列腺素F2α組的終濃度為10μg/ml，轉化生長因子β2組的終濃度為1ng/ml。提取各組黑色素細胞總蛋白，采用WesternBlot印跡法從蛋白表達水平定量檢測各組脈絡膜黑色素細胞的基質金屬蛋白酶及其抑制劑的表達，并用免疫熒光組化染色進行定位。 結果：1.初分離的脈絡膜黑色素細胞呈棕色球狀體，24小時內貼壁。貼壁細胞漸變?yōu)殡p極、三極或樹枝狀，常有較長的分支，胞漿內

5、含有棕黃色色素顆粒，傳代后色素量保持穩(wěn)定。電鏡下可見細胞表面有少量微絨毛，胞漿內的黑素體沿胞膜分布或簇狀分布。體外培養(yǎng)的脈絡膜黑色素細胞對S-100抗體表達陽性，對細胞角蛋白抗體表達陰性。 2.體外培養(yǎng)的人眼脈絡膜黑色素細胞經不同濃度前列腺素F2α處理后與對照組相比細胞形態(tài)改變不明顯，細胞數(shù)目與活性均無明顯改變(P＞0.05)；經不同濃度轉化生長因子β2處理后與對照組相比細胞增殖不活躍，細胞數(shù)目減少、活性降低，且呈劑量依賴性，差

6、別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或0.01)。 3.用抗基質金屬蛋白酶或其抑制劑的特異性抗體，進行WesternBlot分析和免疫熒光組化標記，結果顯示：體外培養(yǎng)的人眼脈絡膜黑色素細胞在未誘導條件下可表達低水平的基質金屬蛋白酶-2；未見基質金屬蛋白酶-1、3、9及組織金屬蛋白酶抑制劑-1、2的信號；經前列腺素F2α處理后的脈絡膜黑色素細胞胞漿中可見明顯基質金屬蛋白酶-1、2、3、9的陽性信號，其中以基質金屬蛋白酶-1上調表達最明顯；

7、經轉化生長因子β2處理后的脈絡膜黑色素細胞胞漿中可見明顯基質金屬蛋白酶-2、3、9的陽性信號，其中以基質金屬蛋白酶-2上調表達最明顯。 結論：1.前列腺素F2α對體外培養(yǎng)的人眼脈絡膜黑色素細胞的生長狀態(tài)無明顯影響；轉化生長因子β2可抑制體外培養(yǎng)人眼脈絡膜黑色素細胞的生長狀態(tài)，且呈劑量依賴性。 2.體外培養(yǎng)的人眼脈絡膜黑色素細胞可表達部分類型的基質金屬蛋白酶，不表達組織金屬蛋白酶抑制劑；前列腺素F2α可上調體外培養(yǎng)人眼脈絡

8、膜黑色素細胞基質金屬蛋白酶-1、2、3、9的表達；轉化生長因子β2可上調體外培養(yǎng)人眼脈絡膜黑色素細胞基質金屬蛋白酶-2、3、9的表達。 3.脈絡膜黑色素細胞在不同的信號因子調控下可以生成不同的基質金屬蛋白酶譜，在不同的疾病發(fā)生機制中扮演相應的角色。脈絡膜黑色素細胞可能通過參與葡萄膜—鞏膜細胞外基質金屬蛋白酶的調控過程，從而成為細胞工程學技術治療青光眼或近視眼的重要媒介。 第—章人眼脈絡膜黑色素細胞的培養(yǎng)與鑒定 目

9、的：觀察體外培養(yǎng)人眼脈絡膜黑色素細胞的生長狀況，用透射電鏡、細胞免疫化學染色鑒定性質，為進一步研究脈絡膜黑色素細胞及相關眼病提供模型。材料和方法：將人新鮮尸眼的脈絡膜組織用胰蛋白酶與膠原酶多次消化，分離得到的細胞用添加胎牛血清、堿性成纖維細胞生長因子、異丁基甲基黃嘌呤、霍亂毒素的F12培養(yǎng)液進行培養(yǎng)、傳代、凍存和復蘇。用透射電鏡、細胞免疫化學染色鑒定細胞性質。 結果：初分離的脈絡膜黑色素細胞呈棕色球狀體，24小時內貼壁。貼壁細胞

10、漸變?yōu)殡p極、三極或樹枝狀，常有較長的分支，胞漿內含有棕黃色色素顆粒，傳代后色素量保持穩(wěn)定。電鏡下可見細胞表面有少量微絨毛，胞漿內的黑素體沿胞膜分布或簇狀分布。體外培養(yǎng)的脈絡膜黑色素細胞對S-100抗體表達陽性，對細胞角蛋白抗體表達陰性。 結論：采用胰蛋白酶與膠原酶多次消化并在培養(yǎng)液中添加多種刺激因子，可以建立人眼脈絡膜黑色素細胞的有限細胞系。 第二章PGF2α與TGF-β2對體外培養(yǎng)人眼脈絡膜黑色素細胞生長狀態(tài)的影響

11、 目的：觀察不同濃度PGF2α和TGF-β2刺激下，體外培養(yǎng)的人眼脈絡膜黑色素細胞數(shù)目與活性的變化，研究兩種因子對脈絡膜黑色素細胞生長狀態(tài)的影響。 材料和方法：將體外培養(yǎng)的人眼脈絡膜黑色素細胞隨機分為對照組、前列腺素F2α組、轉化生長因子β2組。前列腺素F2α組的加入濃度分別為0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml，轉化生長因子β2組的加入濃度分別為0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、1

12、00ng/ml。使用倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)，細胞計數(shù)法和MTT法分別測定各組細胞的數(shù)目與活性。 結果：體外培養(yǎng)的人眼脈絡膜黑色素細胞經不同濃度前列腺素F2α處理后與對照組相比細胞形態(tài)改變不明顯，細胞數(shù)目與活性均無明顯改變(P＞0.05)；經不同濃度轉化生長因子β2處理后與對照組相比細胞增殖不活躍，細胞數(shù)目減少、活性降低，且呈劑量依賴性，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或0.01)。 結論：前列腺素F2α對體外培養(yǎng)的人眼脈

13、絡膜黑色素細胞的生長狀態(tài)無明顯影響；轉化生長因子β2可抑制體外培養(yǎng)人眼脈絡膜黑色素細胞的生長狀態(tài)，且呈劑量依賴性。 第三章PGF2α與TGF-β2對人眼脈絡膜黑色素細胞基質金屬蛋白酶及其抑制劑表達影響的研究 目的：觀察體外培養(yǎng)人眼脈絡膜黑色素細胞基質金屬蛋白酶及其抑制劑的表達，以及PGF2α與TGF-β2對這種表達的影響，探討脈絡膜黑色素細胞的生理功能以及可能參與的兩個信號轉導通路。 材料和方法：將體外培養(yǎng)的人眼

14、脈絡膜黑色素細胞隨機分為對照組、前列腺素F2α組、轉化生長因子β2組，前列腺素F2α組的終濃度為10μg/ml，轉化生長因子β2組的終濃度為1ng/ml。提取各組黑色素細胞總蛋白，采用Western印跡法從蛋白表達水平定量檢測各組脈絡膜黑色素細胞的基質金屬蛋白酶及其抑制劑的表達，并用免疫熒光組化技術進行定位。 結果：用抗基質金屬蛋白酶或其抑制劑的特異性抗體，進行WesternBlot分析和免疫熒光組化標記，結果顯示：體外培養(yǎng)的人

15、眼脈絡膜黑色素細胞在未誘導條件下可表達低水平的基質金屬蛋白酶-2；未見基質金屬蛋白酶-1、3、9及組織金屬蛋白酶抑制劑-1、2的信號；經前列腺素F2α處理后的脈絡膜黑色素細胞胞漿中可見明顯基質金屬蛋白酶-1、2、3、9的陽性信號，其中以基質金屬蛋白酶-1上調表達最明顯；經轉化生長因子β2處理后的脈絡膜黑色素細胞胞漿中可見明顯基質金屬蛋白酶-2、3、9的陽性信號，其中以基質金屬蛋白酶-2上調表達最明顯。 結論：體外培養(yǎng)的人眼脈絡膜