長(zhǎng)鏈非編碼RNA MIR31HG在胰腺癌中發(fā)揮癌基因的作用并受miR-193b的負(fù)調(diào)控.pdf

1、胰腺癌是一種高度惡性的腫瘤，位居美國(guó)致死性腫瘤的第四位，在世界范圍也是最致命的惡性腫瘤之一。近三十年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)診療技術(shù)的進(jìn)步，大多數(shù)其他腫瘤患者的生存率有了顯著提高，但胰腺癌患者的預(yù)后卻沒(méi)有明顯改善。哺乳動(dòng)物全基因組和轉(zhuǎn)錄組研究數(shù)據(jù)顯示，蛋白編碼基因在基因組中只占非常小的比例(1％-2％)，而基因組中的大部分基因編碼大量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)我們預(yù)期的非編碼RNA。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的RNA分子的總稱(chēng)

2、，不編碼蛋白質(zhì)，而是以RNA的形式參與多種重要的生物學(xué)過(guò)程。LncRNA突變及異常表達(dá)與人類(lèi)疾病包括腫瘤有密切聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在多種人類(lèi)腫瘤中異常表達(dá)，雖然部分lncRNA表達(dá)差異可能是繼發(fā)結(jié)果，但多數(shù)lncRNA在細(xì)胞轉(zhuǎn)化中發(fā)揮促癌或者抑癌基因的重要作用。
　　我們從pubmed下載研究45對(duì)胰腺導(dǎo)管腺癌及癌旁組織的全基因組芯片數(shù)據(jù)(GSE28735)，分析其中包含的lncRNA信息，篩選發(fā)現(xiàn)lncRNA MIR31H

3、G是差異表達(dá)最顯著的lncRNA分子之一，其在癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織;然后應(yīng)用real-time qPCR在7種胰腺癌細(xì)胞系(AsPC-1、PANC-1、CFPAC-1、Hs766T、SW1990、BxPC-3及MIA PaCa-2)和正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系hTERT-HPNE以及13對(duì)胰腺癌組織和相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本中進(jìn)行表達(dá)水平的驗(yàn)證，結(jié)果顯示MIR31HG在胰腺癌細(xì)胞及組織中均明顯上調(diào)。我們應(yīng)用CPAT軟件對(duì)其非編碼能力進(jìn)

4、行驗(yàn)證，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示MIR31HG的可能的ORF區(qū)很短，編碼概率極低(＜0.05)，另外，我們將預(yù)測(cè)的ORF區(qū)構(gòu)建C端Flag載體，Western blot進(jìn)一步證實(shí)MIR31HG不具備編碼能力。miR-31位于MIR31HG的內(nèi)含子區(qū)，并且miR-31的轉(zhuǎn)錄受到MIR31HG的調(diào)節(jié)。但敲低MIR31HG后不影響miR31的表達(dá)，而過(guò)表達(dá)或敲低miR31后MIR31HG的表達(dá)也未發(fā)生改變，提示兩者可能各自獨(dú)立發(fā)揮功能。
　　為了研

5、究MIR31HG在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們從功能缺失和功能獲得兩方面研究其功能。通過(guò)siRNA干擾敲低細(xì)胞內(nèi)源性MIR31HG的表達(dá)水平后，胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)減慢，凋亡增加，G1-S期阻滯，遷移和侵襲能力降低;而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MIR31HG表達(dá)載體上調(diào)其水平后，胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)加快，侵襲能力明顯增強(qiáng)。MIR31HG在胰腺癌中可能發(fā)揮癌基因的作用。
　　最近研究發(fā)現(xiàn)所有包含miRNAs應(yīng)答元件的轉(zhuǎn)錄本，包括lncRNA，都可以

6、與miRNAs結(jié)合。我們應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)到miR-193b可以靶向MIR31HG，miR-193b在多種腫瘤（包括胰腺癌）中表達(dá)下調(diào)，可能發(fā)揮腫瘤抑制基因的作用。首先，我們發(fā)現(xiàn)miR-193b在胰腺癌中表達(dá)下調(diào)，并且與MIR31HG的表達(dá)存在顯著地負(fù)相關(guān)關(guān)系。然后，過(guò)表達(dá)miR-193b可以降低細(xì)胞內(nèi)源性MIR31HG的表達(dá)水平，而抑制miR-193b的表達(dá)后MIR31HG表達(dá)顯著上調(diào)，提示miR-193b能夠負(fù)調(diào)控MIR31HG

7、的表達(dá)。進(jìn)一步，應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-193b mimic使熒光素酶活性明顯下降，而轉(zhuǎn)染miR-193b inhibitor使熒光素酶活性明顯升高;而載體結(jié)合位點(diǎn)突變后，miR-193b對(duì)熒光素酶活性的抑制或增強(qiáng)作用均消失，通過(guò)此實(shí)驗(yàn)證明了MIR31HG是miR-193b的直接靶基因。RIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MIR31HG能與Ago2蛋白結(jié)合，而敲低的miR-193b后，與Ago2蛋白結(jié)合的MIR31HG的量明顯減少，提示MI

8、31HG通過(guò)miR-193b而與Ago2蛋白結(jié)合，進(jìn)一步證實(shí)了miR-193b能直接靶向MIR31HG，并且miR-193b以Ago2依賴(lài)的方式調(diào)控MIR31HG表達(dá)。最后，CCK8和Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-193b能夠抑制胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)活性和侵襲能力，并且轉(zhuǎn)染miR-193bmimic能夠取消過(guò)表達(dá)MIR31HG對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的促進(jìn)作用。
　　綜上所述，lncRNA MIR31HG在胰腺癌中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)影響胰腺癌