miR-122靶位基因STAT3調(diào)控長鏈非編碼RNA Lethe促進(jìn)HCV復(fù)制的機(jī)制研究.pdf

1、研究新發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）含有與宿主細(xì)胞微小RNA(microRNA或miRNA)相互作用的調(diào)控序列，對(duì)HCV在肝細(xì)胞中復(fù)制和翻譯具有重要的調(diào)控作用，這為控制丙型肝炎疾病進(jìn)展及開發(fā)新型藥物研究提供了新途經(jīng)。
　　本課題以肝臟特異miR-122為切入點(diǎn)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)得到與miR-122有特異性結(jié)合位點(diǎn)的靶基因STAT3，證實(shí)miR-122在Huh-7細(xì)胞中靶向作用于STA

2、T3基因的3'-UTR抑制其表達(dá)，而HCV競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miR-122可上調(diào)STAT3的表達(dá)，抑制Ⅰ型干擾素表達(dá)，從而抑制細(xì)胞抗病毒免疫反應(yīng)，增強(qiáng)HCV RNA的復(fù)制。同時(shí)，對(duì)LncRNA PCR array法檢測(cè)得到STAT3激活時(shí)上調(diào)最顯著的Lethe基因進(jìn)行進(jìn)一步的研究。Lethe，作為“假基因”LncRNA，可被NF-κB（多種蛋白的復(fù)合體）或者糖皮質(zhì)激素受體激動(dòng)劑激活，調(diào)控炎癥信號(hào)，遏制炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)Huh-7細(xì)胞經(jīng)過STAT3

3、激活因子LIF預(yù)處理后，LncRNA-Lethe表達(dá)顯著上調(diào)。同時(shí)，感染HCVRNA的Huh-7細(xì)胞中Lethe表達(dá)顯著上調(diào)，而Lethe基因的沉默可導(dǎo)致HCV復(fù)制子復(fù)制復(fù)制效率降低，證實(shí)STAT3可以正向調(diào)控Lnc RNA-Lethe基因，促進(jìn)HCV RNA的復(fù)制。轉(zhuǎn)染Lethe siRNA后，Huh-7細(xì)胞內(nèi)干擾素刺激基因(IFN-stimulated gene，ISGs):PKR，OAS和IRF1蛋白質(zhì)水平表達(dá)量上調(diào)，real-t

4、ime PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，其相應(yīng)的mRNA水平表達(dá)量上調(diào)。提示RNA-Lethe可通過調(diào)節(jié)Ⅰ型IFN的免疫反應(yīng)，在HCV的復(fù)制及致病過程中起到了關(guān)鍵的作用。
　　研究獲得了兩個(gè)新的發(fā)現(xiàn):1）STAT3可上調(diào)Lnc-Lethe表達(dá)，促進(jìn)HCV病毒的復(fù)制;2）Lnc-Lethe通過調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素反應(yīng)調(diào)控HCV的復(fù)制。初步探討了miR-122、STAT3、Lnc RNA-Lethe在HCV復(fù)制和宿主免疫應(yīng)發(fā)之間的相互關(guān)系，為HCV的防

5、治提供了理論基礎(chǔ)和新的途徑。
　　主要研究結(jié)果:
　　一、miR-122和STAT3的特異結(jié)合抑制STAT3的表達(dá)
　　生物信息學(xué)軟件TrgetScan在線預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn):STAT3 mRNA和miR-1223'-UTR端堿基(UGAGGU)靶向結(jié)合。為了驗(yàn)證STAT3是否為miR-122的直接靶基因，構(gòu)建了質(zhì)粒pGL3-STAT3（包含STAT33'-UTR567bp片段）及pGL3-STAT3-Mu（包含STAT33'-

6、UTR5個(gè)突變位點(diǎn)）。pGL3-STAT3質(zhì)粒分別同miR-122mimic、miR-122inhibitor共轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞。利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。相對(duì)對(duì)照組，miR-122 mimic導(dǎo)致STAT3表達(dá)降低42.1％，而miR-122 inhibitor則增強(qiáng)STAT3表達(dá)(38.4％)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-122和STAT3的結(jié)合靶位，質(zhì)粒pGL3-STAT3和pGL3-STAT3-Mu分別轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞

7、，雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析顯示，相對(duì)野生株STAT3質(zhì)粒，miR-122突變株質(zhì)粒熒光表達(dá)顯著增強(qiáng)(56.2％，P＜0.05)。以上數(shù)據(jù)表明miR-122通過和STAT33'-UTR區(qū)種子匹配序列的特異結(jié)合抑制STAT3的表達(dá)，提示STAT3是miR-122的直接靶基因。
　　二、HCV RNA可能通過和miR-122的靶向結(jié)合，保護(hù)或增強(qiáng)STAT3的表達(dá)
　　利用復(fù)制子pcDNA3.1-RZ-HCV RNA1b(包含HCV1

8、 b型9658 bp)及pcDNA3.1-RZ-HCV RNA1b-Mu(包含HCV1b型9658 bp，HCV5'-UTR miR-122“種子序列”區(qū)3個(gè)位點(diǎn)突變)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞。24h后qRT-PCR檢測(cè)miR-122含量發(fā)現(xiàn)，相對(duì)突變株， HCV RNA野生株miR-122的量略有減少，但差距并不顯著，這也說明微量的miR-122即可影響HCV RNA的復(fù)制。24h后Western blot檢測(cè)STAT3蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，H

9、CV RNA野生株轉(zhuǎn)染體系中，其表達(dá)相對(duì)HCV RNA突變株顯著上調(diào)。提示HCV RNA可通過和miR-122的靶向結(jié)合，保護(hù)或增強(qiáng)STAT3的表達(dá)。
　　三、HCV RNA通過增強(qiáng)STAT3蛋白表達(dá)，抑制IFN-α和IFN-β表達(dá)，降低抗病毒應(yīng)答
　　通常認(rèn)為STAT3可負(fù)向調(diào)節(jié)IFN介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)。STAT3基因的沉默或敲減可激活I(lǐng)FN-α和IFN-β介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)。本研究在HCV RNA野生株和HCV RNA突變株

10、的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染體系中，分別在轉(zhuǎn)染后0h，4h，8h，12h，24h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，利用qRT-PCR檢測(cè)IFN-α和IFN-β表達(dá)。結(jié)果顯示，HCV RNA野生株轉(zhuǎn)染細(xì)胞體系中，IFN-α和IFN-β的表達(dá)顯著降低，而HCV RNA miR-122突變株和對(duì)照組差異不顯著。提示HCV RNA和miR-122的靶向相結(jié)合，可增強(qiáng)STAT3蛋白表達(dá)，抑制IFN-α和IFN-β表達(dá)，從而降低抗病毒應(yīng)答。
　　四、STAT3的磷酸化促進(jìn)HCV R

11、NA復(fù)制
　　白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)作為STAT3的外源性細(xì)胞因子激活劑加入Huh-7細(xì)胞培養(yǎng)基，不同孵育時(shí)間刺激后轉(zhuǎn)染染HCVJFH-1質(zhì)粒，qRT-PCR檢測(cè)HCV RNA水平發(fā)現(xiàn)HCV RNA增加和LIF刺激時(shí)間相關(guān)。不用濃度LIF刺激Huh-7細(xì)胞，可不同程度促進(jìn)HCV RNA復(fù)制。同樣，HCV的NS5A和NS3蛋白表達(dá)水平顯著增加。STAT3磷酸化抑制劑AG490

12、使細(xì)胞內(nèi)STAT3-Y705水平顯著降低，HCV RNA及蛋白表達(dá)也降低。提示STAT3的磷酸化在HCV的復(fù)制中扮演了十分重要的角色，可誘導(dǎo)特定基因的表達(dá)，在宿主體內(nèi)創(chuàng)造出有利于HCV復(fù)制的環(huán)境。
　　五、Huh-7細(xì)胞中磷酸化STAT3可調(diào)控LneRNA
　　利用LncRNA PCR array檢測(cè)LIF刺激磷酸化STAT3組和空白對(duì)照組細(xì)胞中的LncRNA表達(dá)的差異，差異標(biāo)準(zhǔn)為相對(duì)對(duì)照組2倍以上的增加或降低。發(fā)現(xiàn)多條Ln

13、cRNA的表達(dá)水平發(fā)生了變化。有文獻(xiàn)報(bào)道LncRNA Lethe能夠調(diào)控Ⅰ型干擾素介導(dǎo)的先天性免疫，而Lethe在磷酸化STAT3的細(xì)胞中差異倍數(shù)最顯著，因此選其為研究對(duì)象進(jìn)一步研究。LIF刺激Huh-7細(xì)胞后，Lethe mRNA的表達(dá)水顯著上調(diào)，而AG490刺激后，Huh-7中Lethe表達(dá)量顯著下降。為了研究HCV感染能否調(diào)控Lethe的表達(dá)，對(duì)不同分組（HCV感染組、HCV+AG490組、HCV+LIF組以及空白對(duì)照組）進(jìn)行研究

14、。與空白對(duì)照組相比較，HCV感染細(xì)胞后能顯著上調(diào)Lethe的表達(dá)（4倍）;在HCV感染的細(xì)胞中同時(shí)利用AG490抑制STAT3的磷酸化，則Lethe的上調(diào)被顯著抑制，甚至低于空白對(duì)照組;在HCV感染的細(xì)胞中同時(shí)利用LIF進(jìn)一步促進(jìn)STAT3的磷酸化，Lethe的表達(dá)水平進(jìn)一步上升。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:HCV感染細(xì)胞后能通過促進(jìn)STAT3的磷酸化上調(diào)Lethe的表達(dá)。
　　六、Huh-7細(xì)胞中LncRNA-Lethe的干擾可抑制HCV復(fù)制

15、
　　三條Lethe siRNA及對(duì)照siRNA分別轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞，qRT-PCR結(jié)果顯示三條靶向Lethe的siRNA均在不同程度上抑制Lethe表達(dá)，其中si-Lethe-3的抑制效果最明顯。Huh-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-Lethe-3后，再感染HCV JFH-1。相對(duì)對(duì)照組，HCV RNA水平降低，NS5A和NS3蛋白表達(dá)降低。為了進(jìn)一步確定磷酸化的STAT3通過Lethe促進(jìn)HCV復(fù)制，我們?cè)O(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)分組如下:

16、LIF刺激組、LIF+siRNA-control組、LIF+si-Lethe組和空白對(duì)照組。與空白對(duì)照組相比較，LIF刺激組能顯著上調(diào)HCVNS5A轉(zhuǎn)錄;LIF刺激同時(shí)敲減Lethe后，HCV NS5A轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)。結(jié)果表明:誘導(dǎo)STAT3磷酸化能夠顯著促進(jìn)HCV復(fù)制，磷酸化的STAT3可能通過上調(diào)LncRNALethe促進(jìn)HCV復(fù)制。
　　七、LncRNA-Lethe通過抑制Ⅰ型干擾素介導(dǎo)的免疫應(yīng)答促進(jìn)HCV復(fù)制
　　

17、在HCV感染的Huh-7細(xì)胞中加入Lethe siRNA后，Huh-7細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型干擾素分子PKR，OAS和IRF1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的mRNA表達(dá)水平上調(diào)。為進(jìn)一步確定HCV誘導(dǎo)磷酸化的STAT3在上述Lethe對(duì)Ⅰ型干擾素分子的調(diào)控中的作用。與空白對(duì)照組比較，LIF刺激細(xì)胞后能顯著下調(diào)Ⅰ型干擾素分子PKR，OAS和IRF1的表達(dá);在LIF刺激的細(xì)胞中同時(shí)干擾Lethe后，Ⅰ型干擾素分子PKR,OAS和IRF1的表達(dá)水平達(dá)到最