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文檔簡介
1、目的:
研究miR-29c在胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用
方法:
1.RT-PCR檢測5株不同分化能力胰腺癌細(xì)胞株(PANC-1,BxPc-3,Hs766t,cFPAN,Capan1)的miR-29s的表達(dá),Western Blot及明膠酶譜法檢測5株不同分化能力胰腺癌細(xì)胞MMP2的表達(dá)和活性,利用Spearman等級相關(guān)統(tǒng)計(jì)方法分析在胰腺癌細(xì)胞中miR-29s表達(dá)與MMP2表達(dá)的相關(guān)性。
2.通過轉(zhuǎn)染
2、miRNA mimic和miRNA inhibitor分別構(gòu)建miR-29c的過表達(dá)和干擾表達(dá);CCK-8檢測miR-29c表達(dá)對胰腺癌細(xì)胞增殖能力影響;Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測miR-29c表達(dá)對胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。
3.結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測和熒光素酶活性報(bào)告基因證實(shí)miR-29c調(diào)控MMP2表達(dá)的分子機(jī)制。
4.通過裸鼠原位胰腺癌種植模型篩選出自發(fā)性高肝轉(zhuǎn)移胰腺癌細(xì)
3、胞亞群(Hs766t、Hs766t-L1和Hs766t-L2),分別檢測miR-29c和MMP2的表達(dá),分析其表達(dá)與轉(zhuǎn)移能力的相關(guān)性;利用所獲得高肝轉(zhuǎn)移胰腺癌細(xì)胞活體驗(yàn)證miR-29s對胰腺癌轉(zhuǎn)移能力的影響。
5.RT-PCR檢測胰腺癌組織及其癌旁組織miR-29c的表達(dá),免疫組化檢測胰腺癌組織及其癌旁組織MMP2蛋白表達(dá),分別分析其表達(dá)與臨床病理參數(shù)相關(guān)性;Kaplan-Meier統(tǒng)計(jì)方法分析miR-29c表達(dá)對胰腺癌預(yù)后的
4、影響。
結(jié)果:
1.在胰腺癌細(xì)胞中,miR-29c表達(dá)與MMP2蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
2.過表達(dá)miR-29c對胰腺癌細(xì)胞的增殖能力無影響,但可明顯抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力;干擾miR-29c表達(dá)后可顯著增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
3.生物信息學(xué)預(yù)測提示:MMP2'UTR存在一個miR-29c結(jié)合位點(diǎn);過表達(dá)miR-29c可顯著降低MMP2 mRNA和蛋白表達(dá)水平,干擾miR-29c表達(dá)
5、后可顯著上調(diào)MMP2mRNA和蛋白表達(dá)水平;miR-29c可顯著抑制野生型報(bào)告基因熒光素酶活性,而對突變型報(bào)告基因熒光素酶活性無影響。
4.通過裸鼠原位胰腺癌種植模型,體外分離并培養(yǎng)出自發(fā)性高肝轉(zhuǎn)移胰腺癌細(xì)胞亞群(Hs766t、Hs766t-L1和Hs766t-L2),miR-29c表達(dá)與胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能呈負(fù)相關(guān),而MMP2蛋白表達(dá)與胰腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能呈正相關(guān);利用高轉(zhuǎn)移潛能胰腺癌細(xì)胞Hs766t-L2構(gòu)建裸鼠原位胰腺癌動
6、物模型,過表達(dá)miR-29c明顯抑制裸鼠原位胰腺癌自發(fā)性肝轉(zhuǎn)移。
5.在胰腺癌臨床樣本中,miR-29c的表達(dá)明顯低于其對應(yīng)的癌旁組織,且與MMP2蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān);miR-29c的表達(dá)與胰腺癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM期相關(guān);同時miR-29c的表達(dá)是影響胰腺癌預(yù)后的獨(dú)立因素。
結(jié)論:
1.在細(xì)胞水平和活體水平證實(shí)miR-29c通過靶向調(diào)控MMP2表達(dá)抑制胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移。
2.miR-29
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