FGFsFGFR3與1,25(OH)2D3VDR信號(hào)通路的交互作用及其在軟骨發(fā)育中的作用及意義研究.pdf

1、骨骼是人體重要的組織器官,是機(jī)體機(jī)械運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ)。近年的研究發(fā)現(xiàn),骨骼系統(tǒng)參與了生理及病理?xiàng)l件下機(jī)體代謝、內(nèi)分泌和造血功能的調(diào)控。良好的骨骼發(fā)育是機(jī)體健康的基礎(chǔ),骨骼發(fā)育具體機(jī)制的深入探索對(duì)尋找骨骼疾病新的治療措施與方案具有重要意義。骨骼發(fā)育包括軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨兩種途徑,是一個(gè)高度有序、受到多種因素共同調(diào)控的過程。軟骨內(nèi)成骨是哺乳動(dòng)物骨骼形成的主要途徑。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Fibroblast growth factors,FGFs)

2、及其受體成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(Fibroblast growth factor receptors,FGFRs)在調(diào)節(jié)軟骨內(nèi)成骨中發(fā)揮重要的作用。FGFR3屬于酪氨酸激酶受體家族,其基因突變與多種骨骼發(fā)育性疾病密切相關(guān)。
　　通過對(duì)FGFR3基因工程小鼠的深入研究表明,FGFR3在骨骼發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮重要作用。模擬人軟骨發(fā)育不全的 FGFR3功能增強(qiáng)型(gain-of function)點(diǎn)突變小鼠模型(FGFR3G369C/+小鼠

3、,即ACH小鼠)表現(xiàn)為身材短小,長(zhǎng)骨生長(zhǎng)板結(jié)構(gòu)紊亂,軟骨細(xì)胞增殖速度減慢。ACH小鼠軟骨細(xì)胞的分化受到抑制,表現(xiàn)為肥大軟骨細(xì)胞數(shù)量減少,肥大帶變窄,伴 X型膠原表達(dá)明顯降低。FGFR3全身敲除小鼠則出現(xiàn)與之相反的表型,其長(zhǎng)骨過度生長(zhǎng),出現(xiàn)脊柱側(cè)彎,長(zhǎng)骨生長(zhǎng)板變寬,肥大軟骨細(xì)胞數(shù)量顯著增加,伴隨X型膠原表達(dá)增高。目前觀點(diǎn)認(rèn)為FGFs與受體FGFR3結(jié)合后能夠激活下游STAT1/p21、MAPK、PLC-γ和 PI3K等信號(hào)通路,此外,還能

4、夠與IHH/PTHrP環(huán)路等其他重要信號(hào)通路相互協(xié)調(diào),對(duì)軟骨內(nèi)成骨過程起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。然而目前對(duì)于由 FGFR3突變所致的骨骼發(fā)育性疾病尚無有效的治療措施,科學(xué)家們針對(duì) FGFR3及相關(guān)的信號(hào)通路所采取的干預(yù)措施并不能完全緩解由 FGFR3異常激活所致的骨骼發(fā)育異常。這提示FGFR3激活后可能通過其他的機(jī)制參與了對(duì)骨骼發(fā)育過程的調(diào)控。
　　除了 FGFs/FGFR3外,許多重要的信號(hào)通路也參與了骨骼發(fā)育的調(diào)控,如Wnt/βcate

5、nin、IHH/ PTHrP、1,25(OH)2D3/VDR等。1,25(OH)2D3/VDR信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物鈣、磷代謝及骨穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮重要作用。1,25(OH)2D3與FGF23和PTH一起構(gòu)成調(diào)節(jié)環(huán)路,參與對(duì)鈣磷代謝的精確調(diào)控。近年來研究發(fā)現(xiàn),1,25(OH)2D3/VDR信號(hào)通路同樣參與了軟骨發(fā)育過程的調(diào)控。在體外試驗(yàn)中,我們以及其他課題組的結(jié)果均證實(shí)1,25(OH)2D3對(duì)軟骨細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用,而且大劑量應(yīng)用1,

6、25(OH)2D3能夠抑制小鼠生長(zhǎng)。VDR全身敲除小鼠(VDR-/-)在發(fā)育早期階段就出現(xiàn)長(zhǎng)骨生長(zhǎng)板肥大帶異常增寬,軟骨細(xì)胞排列紊亂;軟骨細(xì)胞中特異性敲除(ColII-cre)VDR后,X型膠原表達(dá)明顯降低。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示1,25(OH)2D3/VDR信號(hào)通路在軟骨內(nèi)成骨的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。重要的是,VDR敲除小鼠的矮小表型與FGFR3功能增強(qiáng)型小鼠的侏儒表型相似,提示 FGFs/FGFR3與1,25(OH)2D3/VDR通路之

7、間可能存在交互作用(Crosstalk)。前期研究顯示,多個(gè)蛋白可以通過與 VDR蛋白直接相互作用,調(diào)控1,25(OH)2D3/VDR通路的活性與功能。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),大部分與VDR有直接作用的蛋白質(zhì)分子都含有一段保守序列,即LXXLL序列。FGFR3胞內(nèi)段第705位氨基酸殘基開始即為L(zhǎng)FKLL,提示FGFR3有可能與VDR直接結(jié)合,通過調(diào)控1,25(OH)2D3/VDR通路的活性與功能,進(jìn)而參與軟骨內(nèi)成骨的調(diào)節(jié),但目前缺乏相關(guān)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)

8、。
　　本研究中,我們利用組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等相關(guān)的技術(shù)與方法,研究FGFR3與VDR受體之間的交互作用及其機(jī)制,并利用體外組織培養(yǎng)模型初步探討FGFs/FGFR3與VDR信號(hào)通路的交互作用在軟骨內(nèi)成骨中的作用及意義。
　　主要實(shí)驗(yàn)方法:
　　1. FGFR3與VDR受體分子間直接相互作用的研究
　　采用細(xì)胞免疫熒光、免疫共沉淀等方法研究FGFR3與VDR受體之間的相互作用。
　　1.1、細(xì)

9、胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FGFR3與VDR的共定位。
　　1.2、YFP-PCA熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FGFR3與VDR的共定位。
　　1.3、檢測(cè)生理?xiàng)l件下VDR與FGFR3內(nèi)源性相互作用。
　　1.4、293T細(xì)胞中FGFR3與VDR受體間相互作用的檢測(cè)。
　　1.5、通過轉(zhuǎn)染不同激活形式的FGFR3表達(dá)載體,檢測(cè)FGFR3的激活形式對(duì)相互作用的影響。
　　2. FGFs/FGFR3信號(hào)通路對(duì)1,25(OH)2D3/V

10、DR信號(hào)通路的影響
　　2.1、免疫組化檢測(cè)FGFR3基因突變小鼠長(zhǎng)骨生長(zhǎng)板VDR受體蛋白水平的變化
　　2.2、檢測(cè)FGFR3基因突變對(duì)原代軟骨細(xì)胞內(nèi)VDR蛋白水平的影響。
　　2.3、檢測(cè)FGFR3通路的活性對(duì)VDR蛋白水平的影響(通過加入FGFR3的配體、抑制劑進(jìn)行干預(yù))。
　　2.4、外源FGFR3對(duì)胞內(nèi)VDR蛋白水平的影響。
　　2.5、定量PCR檢測(cè)FGFR3基因敲除對(duì)VDR轉(zhuǎn)錄水平的影響。

11、r>　　2.6、定量PCR檢測(cè)RNAi干擾FGFR3后對(duì)VDR轉(zhuǎn)錄水平的影響。
　　3.1、25(OH)2D3對(duì)FGFs/FGFR3信號(hào)通路的影響
　　3.1、通過在NIH3T3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ERK報(bào)告基因,觀察1,25(OH)2D3對(duì)ERK1/2轉(zhuǎn)錄的影響。
　　3.2、檢測(cè)1,25(OH)2D3對(duì)軟骨細(xì)胞FGFR3信號(hào)激活后磷酸化ERK1/2蛋白水平的影響。
　　4. VDR與FGFR3受體間的相互作用對(duì)軟骨發(fā)育

12、的影響
　　4.1、 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)1,25(OH)2D3對(duì)軟骨細(xì)胞增殖能力的影響。
　　4.2、利用體外組織培養(yǎng)模型觀察1,25(OH)2D3/VDR信號(hào)通路之間的串話作用對(duì)小鼠跖骨生長(zhǎng)的影響。
　　主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1. FGFR3與VDR受體間存在相互作用
　　本課題通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) FGFR3與 VDR存在共定位,然后進(jìn)一步利用YFP-PCA實(shí)驗(yàn)證實(shí)FGFR3與VDR在細(xì)胞內(nèi)有共定位,二者共同定

13、位于細(xì)胞質(zhì)靠近核的區(qū)域;通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)在不同細(xì)胞系內(nèi)FGFR3與VDR受體間均存在相互作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)FGFR3與VDR之間的相互作用依賴于FGFR3酪氨酸激酶活性, VDR不能被失活型突變的FGFR3特異性的沉淀。
　　2. FGFs/FGFR3信號(hào)通路對(duì)1,25(OH)2D3/VDR信號(hào)通路的影響
　　我們通過免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ACH小鼠脛骨生長(zhǎng)板處VDR表達(dá)量降低,而FGFR3敲除后小鼠脛骨生長(zhǎng)板處VDR表達(dá)

14、顯著增高。Western Blotting實(shí)驗(yàn)證實(shí)原代軟骨細(xì)胞內(nèi)FGFR3激活型突變能降低VDR蛋白水平,而敲除FGFR3(他莫昔芬誘導(dǎo))后VDR蛋白量明顯升高。通過加入FGFR3的配體FGF18、酪氨酸激酶抑制劑PD173074,從配體水平干預(yù)原代軟骨細(xì)胞內(nèi)FGFR3的活性狀態(tài),證實(shí)FGFR3對(duì)VDR蛋白水平的下調(diào)作用與酪氨酸激酶活性有關(guān),這提示在生理?xiàng)l件下未發(fā)生突變的 FGFR3受體也能通過自身活性的變化對(duì)VDR蛋白水平起調(diào)節(jié)作用;

15、此外,通過轉(zhuǎn)染不同劑量的野生型FGFR3表達(dá)載體,我們發(fā)現(xiàn)FGFR3對(duì)VDR蛋白水平的下調(diào)作用存在劑量依賴效應(yīng)。定量PCR結(jié)果顯示FGFR3不影響VDR的轉(zhuǎn)錄水平,提示FGFR3在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控VDR蛋白水平,并調(diào)控VDR相關(guān)信號(hào)通路。
　　3.1,25(OH)2D3對(duì)FGFs/FGFR3信號(hào)通路的影響
　　雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示1,25(OH)2D3有效抑制由FGFR3受體活化而引起的下游信號(hào)通路的激活。此外,We

16、stern Blotting證實(shí)1,25(OH)2D3能夠顯著降低磷酸化ERK1/2的蛋白水平,從而對(duì)FGFs/FGFR3信號(hào)通路起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。
　　4. VDR與FGFR3受體間的相互作用對(duì)軟骨內(nèi)成骨的影響
　　我們通過MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1,25(OH)2D3能夠抑制ATDC5細(xì)胞的增殖能力,這進(jìn)一步證實(shí)VDR信號(hào)通路可能參與了對(duì)軟骨內(nèi)成骨的調(diào)控。此外,利用體外跖骨培養(yǎng)模型模擬體內(nèi)軟骨內(nèi)成骨的過程,發(fā)現(xiàn)1,25(OH)2D3

17、可有效緩解由FGFR3激活型突變引起的跖骨生長(zhǎng)速度的延緩。
　　主要結(jié)論:
　　1. FGFR3與VDR受體間存在相互作用。
　　2. FGFs/FGFR3通過與1,25(OH)2D3/VDR信號(hào)通路的交互作用,降低VDR的蛋白水平;1,25(OH)2D3能抑制FGFR3下游ERK1/2的磷酸化水平,從而相互產(chǎn)生負(fù)性調(diào)控作用。
　　3.體外培養(yǎng)模型顯示1,25(OH)2D3可緩解FGFR3功能增強(qiáng)所致的軟骨生長(zhǎng)抑