骨形成相關(guān)因子和1,25(OH)2D3-VDR在腎結(jié)石形成機(jī)制中的研究.pdf

1、目的：
　　通過構(gòu)建的遺傳性高鈣尿大鼠模型，探討骨形成相關(guān)因子和1,25(OH)2D3/VDR在腎結(jié)石形成中的作用。
　　方法：
　　1.18只大鼠被分成2組，10只20代高鈣尿大鼠作為實(shí)驗組，8只體重與高鈣尿大鼠相當(dāng)?shù)腟D大鼠作為對照組。大鼠處死后取出腎臟，應(yīng)用RT-PCR和Western blot分別檢測兩組大鼠腎組織中BMP2,Runx2,Osterix,MSX2,OPN和ALP在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。

2、>　　2.45只22代高鈣尿大鼠和30只23代高鈣尿大鼠被分成三組，每組25只，分別為生理鹽水組，VDR干擾組和空病毒組。在實(shí)驗開始前和開始后的第3、7、14和28天，每組分別處死5只高鈣尿大鼠，檢測兩組大鼠腎組織中BMP2,Runx2,Osterix和OPN在mRNA和蛋白水平的表達(dá)；應(yīng)用Van kossa染色法顯示腎組織鈣化情況；應(yīng)用免疫組化法檢測OPN的表達(dá)。
　　3.取高鈣尿大鼠腎臟，分離、培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞。將腎小管上皮

3、細(xì)胞分別用生理鹽水，VDR慢病毒載體和空病毒載體進(jìn)行處理，在細(xì)胞處理后6，12，24，48和96小時后分別收集細(xì)胞，檢測處理前后不同時間點(diǎn)BMP2,Runx2和Osterix在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。同時檢測VDR干擾前后細(xì)胞鈣化的變化。
　　4.在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入1,25(OH)2D3，共同孵育6，12，24，48和96小時后分別收集細(xì)胞，檢測孵育前后不同時間點(diǎn)BMP2,Runx2和Osterix在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。同

4、時檢測1,25(OH)2D3處理前后細(xì)胞鈣化的變化。
　　結(jié)果：
　　1.骨相關(guān)因子在高鈣尿大鼠和SD大鼠中的表達(dá)：RT-PCR結(jié)果顯示，BMP2(p<0.01), Runx2(p=0.045), Osterix(p=0.001)和OPN(p<0.01)在高鈣尿大鼠腎組織中的表達(dá)明顯增高。但是兩組中MSX2(p=0.088)和ALP(p=0.116)的表達(dá)沒有統(tǒng)計學(xué)意義（p＞0.05）。Western blot結(jié)果與RT-P

5、CR結(jié)果相似。
　　2.VDR對BMP2通路信號相關(guān)分子的調(diào)控作用：RT-PCR結(jié)果顯示，VDR干擾組中BMP2,Runx2和Osterix的表達(dá)水平在實(shí)驗開始后的第7,14和28天明顯降低，而在生理鹽水組和空病毒組中，BMP2,Runx2和Osterix的mRNA表達(dá)水平在各個時間點(diǎn)均無明顯變化。Western blot結(jié)果同樣顯示，VDR基因沉默降低了高鈣尿大鼠腎組織中BMP2,Runx2和Osterix的蛋白表達(dá)水平。

6、>　　3.VDR對高鈣尿大鼠腎組織中鈣磷沉積的調(diào)控作用：Van kossa染色結(jié)果顯示，鈣磷沉積于高鈣尿大鼠皮質(zhì)和髓質(zhì)的腎小管內(nèi)。VDR基因沉默后，腎小管內(nèi)的鈣磷沉積在實(shí)驗開始后的第7,14和28天明顯降低，但是在空病毒組中，直到處理后的第28天，腎小管內(nèi)的鈣磷沉積依然無明顯變化。
　　4.VDR對OPN的調(diào)控作用：RT-PCR結(jié)果顯示，VDR基因沉默后，OPN的表達(dá)水平在實(shí)驗開始后的第7,14和28天明顯降低，并且在第14天達(dá)到

7、了最低水平。Western blot顯示出了與RT-PCR相似的結(jié)果。免疫組化結(jié)果顯示，OPN表達(dá)于高鈣尿大鼠腎小管上皮細(xì)胞的胞質(zhì)，而且OPN在腎皮質(zhì)和髓質(zhì)的表達(dá)均較為豐富，但VDR基因沉默后，OPN在腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)明顯降低。
　　5.VDR基因沉默對腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)骨相關(guān)因子表達(dá)的影響:RT-PCR結(jié)果顯示，VDR慢病毒載體轉(zhuǎn)染后，BMP2,Runx2和Osterix的表達(dá)明顯降低(P<0.01)，并且隨著轉(zhuǎn)染時間的延長

8、，其下降程度越來越明顯，Western blot顯示出了與RT-PCR相似的結(jié)果。
　　6.VDR基因沉默對腎小管上皮細(xì)胞鈣化的影響：采用Yang Hsueh的方法對細(xì)胞鈣化進(jìn)行檢測，其結(jié)果顯示，VDR干擾組中腎小管上皮細(xì)胞鈣化水平明顯降低，而在生理鹽水組和空病毒組中，腎小管上皮細(xì)胞鈣化水平在各個時間點(diǎn)均無明顯變化。
　　7.1,25(OH)2D3對腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)骨相關(guān)因子表達(dá)的影響：RT-PCR結(jié)果顯示，腎小管上皮細(xì)胞與

9、1,25(OH)2D3共同孵育12小時后，BMP2,Runx2和Osterix的表達(dá)水平開始持續(xù)升高，在孵育96小時后，BMP2,Runx2和Osterix的表達(dá)水平升高了2倍。Western blot結(jié)果顯示，腎小管上皮細(xì)胞與1,25(OH)2D3共同孵育后，BMP2,Runx2和Osterix的蛋白表達(dá)水平明顯升高。
　　8.1,25(OH)2D3對腎小管上皮細(xì)胞鈣化的影響：應(yīng)用Von Kossa法對腎小管上皮細(xì)胞進(jìn)行染色，其

10、結(jié)果顯示，1,25(OH)2D3與腎小管上皮細(xì)胞共同孵育96h后，VD3組胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)礦物沉積的細(xì)胞較多，并且染色更深，對照組僅有少量細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)礦物沉積的現(xiàn)象。同時Yang Hsueh法的結(jié)果顯示，1,25(OH)2D3與腎小管上皮細(xì)胞共同孵育12小時后，細(xì)胞內(nèi)的鈣磷沉積開始持續(xù)升高，在孵育96小時后，VD3組中BMP2,Runx2和Osterix的表達(dá)水平升高了2.14倍。
　　結(jié)論：
　　1.BMP2，Runx2，Os