肝寧方對(duì)正常人體肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激GRP78的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和糖類(lèi)的重要合成場(chǎng)所，是細(xì)胞內(nèi)鈣離子的儲(chǔ)存場(chǎng)所，與物質(zhì)運(yùn)輸、交換、解毒有密切相關(guān)的關(guān)系。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主要是細(xì)胞的一種重要自我防御機(jī)制，強(qiáng)烈持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激最終誘導(dǎo)細(xì)胞不可逆的傷害甚至凋亡。而肝臟細(xì)胞內(nèi)富含有許多的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，目前研究表明許多肝臟疾病都涉及到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　目的:近年來(lái)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被廣大學(xué)者所關(guān)注，發(fā)現(xiàn)其余肝臟疾病有著密切的關(guān)系。本研究的主要目的是探查GRP78對(duì)誘導(dǎo)正常人體肝細(xì)胞HL7702發(fā)生

2、ERS有何密切的關(guān)系。
　　方法:含藥血清的制備:SPF級(jí)SD大鼠20只，給予25g/(kg·d)，灌胃給藥，2次/d，連續(xù)給藥7天，最后1d禁食24h。末次給足全天藥量2h后，麻醉，腹主動(dòng)脈取血。血液需37℃水浴60min，3000r/min離心15min，然后取上清。56℃水浴30min滅活補(bǔ)體，過(guò)濾除菌，-57℃條件下真空干燥48h形成干燥粉末，保存?zhèn)溆?。將RPMI-1640培養(yǎng)液中加入含藥血清，體積分?jǐn)?shù)為20％(即20mL

3、含藥血清加培養(yǎng)液至100mL)，正常血清組（含正常大鼠血清為20％）。細(xì)胞株:采用人正常肝細(xì)胞株HL-7702。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型的建立:細(xì)胞正常培養(yǎng)72h后，加入0.10ug/mL衣霉素培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。分組與給藥:將細(xì)胞分成3組，分別為正常對(duì)照組，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型組，肝寧方治療組。將重懸于RPMI-1640含藥完全培養(yǎng)基的細(xì)胞，每組5個(gè)復(fù)孔，每孔加1mL細(xì)胞懸液，加入含藥血清培養(yǎng)液1mL，濃度為10ug/mL，培養(yǎng)72h后分離細(xì)胞。細(xì)胞培

4、養(yǎng)爬片，以抗GRP78為一抗進(jìn)行標(biāo)記，4℃過(guò)夜孵育，用FITC標(biāo)記的二抗進(jìn)行追蹤標(biāo)記，避光孵育2h，漂洗，甘油封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察GRP78在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及胞漿中的分布情況。RT-PCR檢測(cè)GRP78mRNA。Western blot檢測(cè)GRP78蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察到的GRP78密度，隨著依霉素的增高而增高。Western blot結(jié)果顯示正常組、模型組、治療組內(nèi)GRP78的表達(dá)情況:正常肝細(xì)胞中的G

5、RP78的蛋白條帶較淡，而模型組細(xì)胞中GRP78蛋白條帶較亮，治療組細(xì)胞中的GRP78蛋白條帶也較淡。與正常組相比，模型組內(nèi)的GRP78表達(dá)量明顯提高(P＜0.05)而與治療組內(nèi)的GRP78表達(dá)相比，模型組比治療組的表達(dá)含量明顯提高(P＜0.05)，而正常組與治療組表達(dá)含量沒(méi)有太大區(qū)別（P＞0.05）。并且隨著濃度的增加條帶的顏色也加深。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果:與正常肝細(xì)胞細(xì)胞相比，0.3ug/ml、0.5ug/ml模型組中的GRP78的

6、表達(dá)水平顯著上升，與正常組相比有顯著差別(P＜0.05)，治療后GRP78的表達(dá)水平顯著下降，與正常組表達(dá)無(wú)明顯區(qū)別(P＞0.05)。1ug/ml模型組中的GRP78的表達(dá)水平顯著上升，與正常組相比有顯著差別(P＜0.05)，治療后GRP78的表達(dá)水平顯著下降，與模型組有顯著差別(P＜0.05)，但與正常組表達(dá)有顯著區(qū)別(P＜0.05)。
　　結(jié)論:(1)衣霉素誘導(dǎo)正常人體肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)模型成功。(2)隨著衣霉素濃度的