基質(zhì)硬度對正常人類肝(LO2)細胞內(nèi)自噬體分布的影響的研究.pdf

1、在各個器官中，細胞周圍都是柔軟的組織，而不是玻璃，塑料那樣硬的表面，但是幾乎所有的關于細胞的實驗都是在玻璃，塑料表面進行的，然而細胞外基質(zhì)硬度會對細胞產(chǎn)生很大的影響。它能刺激腫瘤的形成，肝癌的形成就是一個很好地例子，由于肝纖維化和肝硬化使得正常肝組織慢慢變硬從而促進了肝癌的發(fā)展。此外，自噬在肝臟疾病中也扮演著重要的角色，研究發(fā)現(xiàn)肝癌細胞系與正常細胞系相比較而言自噬水平降低了，暗示自噬在腫瘤的中起到抑制的作用，然而在腫瘤的發(fā)展過程中細胞外

2、基質(zhì)硬度是否會影響自噬還不清楚。
　　因為LC3-II的含量與自噬體相關，而且LC3-II出現(xiàn)在自噬過程的各個階段，所以選取LC3作為自噬的標記蛋白，但是有研究表明LC3是一種很容易聚集的蛋白，瞬時轉(zhuǎn)染的暫時性過表達容易引起LC3的聚集，所以構建了能穩(wěn)定表達自噬標記蛋白LC3的LO2穩(wěn)定細胞系是必要的。為了研究基底硬度與自噬的關系，我們構建了能穩(wěn)定表達自噬標記蛋白LC3的LO2穩(wěn)定細胞系。我們采用一種相比于傳統(tǒng)方法更方便，高效的方

3、法，將瞬時轉(zhuǎn)染后的細胞按照2000/孔，1000/孔，500/孔的比例種到96孔板中篩選15天，成功構建了4株穩(wěn)定表達自噬標記蛋白GFP-LC3 LO2單克隆穩(wěn)定細胞系，選擇其中GFP-LC3表達量最高的一株進行后期的實驗。
　　通過改變固化劑和聚二甲硅氧烷（PDMS）的比例，我們制備出了11 kPa，124 kPa，1220 kPa三種硬度的PDMS基底，將LO2細胞培養(yǎng)在這三種硬度的基底和塑料表面（作為對照）48小時，接下來用

4、熒光顯微鏡觀察細胞中自噬體的位置，用免疫印跡法分析LC3-II的表達量，結果顯示不管是24小時還是48小時，LC3-II的表達量并沒有顯著地差異，所以我們推斷基質(zhì)硬度對自噬水平的影響并不大，然而不同硬度的基底卻對LO2細胞中自噬體的分布影響很大，更具體些，在軟的基底上（11 kPa PDMS基底）培養(yǎng)48小時的LO2細胞中的自噬體在細胞核周圍聚集成一個球狀，而硬的基底（1220 kPa PDMS基底）或是塑料基底上的細胞中的自噬體仍然是