內(nèi)質(zhì)網(wǎng)慶激介導(dǎo)COPD肺泡上皮細(xì)胞凋亡及GRP78抗凋亡作用.pdf

1、研究背景：肺泡上皮細(xì)胞凋亡是COPD發(fā)病的重要機(jī)制之一。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑是一條新的細(xì)胞凋亡途徑。有關(guān)ERS標(biāo)志性分子GRP78的生物學(xué)功能的研究已經(jīng)引起生物學(xué)家們的廣泛重視,GRP78在ERS時(shí)表達(dá)增加,被認(rèn)為可以減輕ERS,從而減少細(xì)胞凋亡。GRP78表達(dá)上調(diào)的信號(hào)傳導(dǎo)通路目前不完全清楚,有研究提示p38MAPK途徑可以上調(diào)GRP78的表達(dá)。吸煙是COPD最重要的發(fā)病因素。香煙煙霧中富含氧自由基和多種毒性成分,氧

2、化應(yīng)激和毒性物質(zhì)都是ERS的誘發(fā)因素,因此吸煙很可能觸發(fā)ERS。國內(nèi)外研究均證實(shí),在COPD中,香煙煙霧可以引起p38MAPK的活化。結(jié)合上述研究,我們推測(cè)在COPD發(fā)生過程中,吸煙可能通過誘導(dǎo)ERS導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞凋亡從而參與COPD肺氣腫的形成,在此過程中GRP78表達(dá)上調(diào),發(fā)揮抗凋亡作用,p38MAPK途徑在香煙煙霧誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞GRP78表達(dá)過程中起重要的調(diào)控作用。本研究擬以COPD大鼠及香煙煙霧提取物(CSE)干預(yù)的A549

3、細(xì)胞為主要模型,探討香煙煙霧誘導(dǎo)ERS的發(fā)生、GRP78的抗凋亡作用以及p38MAPK途徑在GRP78表達(dá)過程中的調(diào)控作用。
　　 第一章 COPD大鼠肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞凋亡
　　 目的：觀察COPD大鼠肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生及肺泡上皮細(xì)胞的調(diào)亡情況。
　　 方法：24只Wistar大鼠隨機(jī)均分為2組:正常對(duì)照組和COPD模型組。采用被動(dòng)吸煙加氣管內(nèi)注射脂多糖法建立COPD大鼠模型。造模完成后,測(cè)定各組大鼠的

4、肺功能、觀察肺組織病理學(xué)變化、免疫組化檢測(cè)GRP78在肺組織中的表達(dá)和分布,RT-PCR檢測(cè)GRP78、CHOPmRNA水平,Western blot檢測(cè)GRP78、CHOP、active caspase-12蛋白水平。TUNEL法檢測(cè)肺泡上皮細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果： COPD模型組大鼠FEV0.3/FVC(％)、動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性(Cdyn)均較對(duì)照組明顯降低,而氣道阻力(RI)明顯增高;免疫組化結(jié)果顯示GRP78表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞

5、、支氣管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞的細(xì)胞漿中,以肺泡上皮細(xì)胞明顯。對(duì)照組GRP78呈弱陽性表達(dá),陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒;模型組GRP78呈強(qiáng)陽性表達(dá),陽性產(chǎn)物為棕褐色顆粒。與對(duì)照組相比,模型組肺組織GRP78表達(dá)顯著增高;RT-PCR結(jié)果顯示COPD模型組大鼠支氣管肺組織中GRP78 mRNA和CHOPmRNA表達(dá)量較對(duì)照組顯著增高;Western blot結(jié)果顯示COPD模型組大鼠肺組織中GRP78、CHOP、active caspa

6、se—12蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增高;TUNEL法結(jié)果顯示COPD模型組肺泡上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)較正常對(duì)照組顯著增高。
　　 結(jié)論：采用被動(dòng)吸煙加氣管內(nèi)注射脂多糖的方法,成功復(fù)制出了COPD大鼠模型;COPD大鼠肺組織發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,尤以肺泡上皮細(xì)胞明顯;COPD大鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡增加,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能是介導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡的重要途徑。
　　 第二章香煙煙霧提取物誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞GRP78的表達(dá)及其抗凋亡作用

7、　　 目的：觀察CSE對(duì)A549細(xì)胞GRP78表達(dá)的影響,并探討GRP78抗細(xì)胞凋亡作用。
　　 方法：第一部分,體外培養(yǎng)A549細(xì)胞,給予不同濃度(0％-10％)和不同時(shí)間(0h-24h)的CSE干預(yù)后,以RT-PCR、Western blot分別檢測(cè)GRP78 mRNA和蛋白表達(dá);第二部分,將A549細(xì)胞分為四個(gè)處理組:對(duì)照組,5％CSE組,GRP78siRNA+5％CSE組,controlsiRNA+5％CSE組。以RT

8、—PCR、Western blot分別檢測(cè)GRP78 mRNA和蛋白的表達(dá)水平,Western blot檢測(cè)active caspase-3蛋白表達(dá)水平,TUNEL檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)的變化。
　　 結(jié)果：隨著CSE濃度的增加或干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng),A549細(xì)胞GRP78 mRNA及GRP78蛋白表達(dá)量逐漸增加,以5％CSE、干預(yù)12h組增加最明顯,但繼續(xù)增加CSE濃度或延長(zhǎng)干預(yù)時(shí)間,GRP78表達(dá)并不增加,反而下降;小干

9、擾GRP78后,RT-PCR、Western blot檢測(cè)小干擾組GRP78表達(dá)顯著下降,GRP78siRNA成功下調(diào)了GRP78基因表達(dá); GRP78水平下調(diào)后,A549細(xì)胞active caspase-3的蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡指數(shù)與單純的CSE刺激組比較顯著升高。
　　 結(jié)論：低濃度、短時(shí)間CSE刺激后,A549細(xì)胞啟動(dòng)了保護(hù)性的非折疊蛋白反應(yīng),GRP78表達(dá)上調(diào)。但高濃度、長(zhǎng)時(shí)間CSE刺激,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)功能障礙,其保護(hù)機(jī)制

10、失代償,GRP78表達(dá)反而下降;GRP78抵抗香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡。
　　 第三章 p38MAPK在香煙煙霧提取物誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞GRP78表達(dá)過程中的調(diào)控
　　 目的：明確p38MAPK在CSE誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞GRP78表達(dá)過程中的調(diào)控作用。
　　 方法：第一部分,24只Wistar大鼠隨機(jī)均分為2組:正常對(duì)照組和COPD模型組。采用被動(dòng)吸煙加氣管內(nèi)注射脂多糖法建立大鼠COPD模型。造模完成后,

11、Western blot檢測(cè)各組大鼠肺組織內(nèi)P-p38、GRP78蛋白表達(dá)水平,并將二者進(jìn)行相關(guān)性分析;第二部分,將A549細(xì)胞分為三個(gè)處理組:對(duì)照組,5％CSE組,SB203580+5％CSE組,以RT-PCR、Western blot分別檢測(cè)GRP78 mRNA和蛋白的表達(dá)水平變化。
　　 結(jié)果： COPD模型組大鼠支氣管肺組織中P-p38蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高,且P-p38蛋白水平與GRP78蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0