海藻糖對(duì)未轉(zhuǎn)染和已轉(zhuǎn)染人野生型或A53T突變型α突觸核蛋白基因的PC12細(xì)胞的促自噬作用研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)是常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病,但迄今該病病因和發(fā)病機(jī)制未明。路易小體(Lewybody)是PD患者腦內(nèi)特征性的病理學(xué)標(biāo)志,異常聚集的α突觸核蛋白(α-synuclein)是家族遺傳性和散發(fā)性PD患者腦內(nèi)路易小體的主要成份。α突觸核蛋白的病理性積聚是PD臨床癥狀發(fā)生、發(fā)展及受累腦區(qū)變性的重要原因。如何阻斷α-synuclein的異常沉積或者促進(jìn)聚集的α-synuclein降解是當(dāng)前PD研究中

2、的重要課題。近年來(lái),相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)海藻糖通過(guò)與蛋白質(zhì)分子間的相互作用,可抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性病中相關(guān)蛋白的異常聚集。海藻糖還可促進(jìn)強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染人A53T突變型α-synuclein基因的PC12細(xì)胞自噬,并且能促使突變的α-synuclein降解。我們利用慢病毒表達(dá)載體,建立長(zhǎng)期穩(wěn)定過(guò)表達(dá)人野生型和A53T突變型α-synuclein的PC12細(xì)胞株,利用蛋白酶體抑制劑(MG132)抑制α-synuclein降解,建立α-synuc

3、lein異常聚集的PD細(xì)胞模型,觀察海藻糖是否對(duì)未轉(zhuǎn)染的PC12細(xì)胞、過(guò)表達(dá)人野生型和A53T突變型α-synuclein的PC12細(xì)胞有相似的促自噬作用,并且能否使異常聚集的野生型和A53T突變型α-synuclein降解;另外,自噬的增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞的存活是否有影響。
　　第一部分 人野生型和A53T突變型α-突觸核蛋白慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及在PC12細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染
　　目的：構(gòu)建長(zhǎng)期穩(wěn)定過(guò)表達(dá)人野生型和A53T突變型α-突觸核

4、蛋白的PC12細(xì)胞株。
　　材料和方法：首先制備慢病毒表達(dá)載體,經(jīng)測(cè)序鑒定正確后轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞,然后通過(guò)細(xì)胞的免疫熒光染色檢測(cè)α-synuclein-V5融合蛋白,PCR法擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因PC12細(xì)胞的SNCA片段后進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)突變基因,WesternBlot法檢測(cè)PC12細(xì)胞α-synuclein的表達(dá)從而鑒定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞能否穩(wěn)定表達(dá)目的基因,MTT法測(cè)細(xì)胞活力,繪制生長(zhǎng)曲線。
　　結(jié)果：經(jīng)測(cè)序,pLenti6/V5-SNCA-

5、WT和pLenti6/V5-SNCA-A53T表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功;免疫熒光染色示基因轉(zhuǎn)染后,大于95％的PC12細(xì)胞中有α-synuclein-V5融合蛋白表達(dá);轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的SNCA片段測(cè)序結(jié)果顯示,慢病毒表達(dá)載體成功整合入PC12細(xì)胞基因組;WesternBlot法檢測(cè)結(jié)果示轉(zhuǎn)基因PC12細(xì)胞能夠過(guò)表達(dá)α-synuclein蛋白。3種細(xì)胞生長(zhǎng)曲線無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論：我們已成功構(gòu)建了人野生型和A53T突變型α-突觸核蛋白慢病毒表

6、達(dá)載體,并且成功建立了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)人野生型和A53T突變型α-突觸核蛋白的PC12細(xì)胞株,過(guò)表達(dá)人野生型和A53T突變型α-突觸核蛋白對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯影響。
　　第二部分海藻糖促進(jìn)未轉(zhuǎn)染和已轉(zhuǎn)染人野生型或A53T突變型α突觸核蛋白基因的PC12細(xì)胞自噬
　　目的：研究海藻糖對(duì)未轉(zhuǎn)染和已轉(zhuǎn)染人野生型或A53T突變型α-synuclein基因的PC12細(xì)胞的促自噬作用。
　　材料和方法：用不同濃度(10mM、50mM和100

7、mM)的海藻糖干預(yù)細(xì)胞24h,然后用免疫熒光檢測(cè)自噬泡及自噬溶酶體,用透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬泡數(shù)量的變化,用免疫印跡檢測(cè)LC3II和α-synuclein的表達(dá),觀察海藻糖對(duì)細(xì)胞是否有促自噬作用,能否促進(jìn)過(guò)表達(dá)的人野生型和A53T突變型α-synuclein降解;用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力,觀察海藻糖對(duì)細(xì)胞有無(wú)損傷或保護(hù)作用。
　　結(jié)果：50mM和100mM的海藻糖能使細(xì)胞內(nèi)自噬泡和自噬溶酶體顯著增多,并且使LC3II的表達(dá)量顯著上調(diào)

8、(P<0.01),同時(shí)促進(jìn)A53T突變型α-synuclein的降解(50mM海藻糖組,P<0.05;100mM海藻糖組,P<0.01),而對(duì)WT型α-synuclein無(wú)明顯影響(P>0.05);給予2mM3-MA預(yù)孵育3小時(shí)可以阻斷海藻糖的促自噬作用;50mM和100mM海藻糖均能降低PC12細(xì)胞和A53T轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的活力(P<0.01),僅100mM海藻糖能降低WT轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活力(P<0.05)。海藻糖對(duì)WT轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的損傷作用較