Sp1和長鏈非編碼RNA CDKN2B-AS1的負反饋調節(jié)作用對胃癌細胞增殖作用的機制研究.pdf

1、研究背景：
　　轉錄因子Sp1通過序列特異性的DNA結合蛋白與靶基因啟動子區(qū)GC/GT盒結合調控基因表達，在細胞增生、凋亡、分化和腫瘤形成過程中發(fā)揮重要作用，是影響腫瘤患者預后的重要因素。Sp1啟動子區(qū)有包括Sp1在內等多種轉錄因子的結合位點，可影響Sp1轉錄活性，但胃癌發(fā)生過程中是否發(fā)生Sp1啟動子區(qū)遺傳學異常并引起細胞惡性轉化還不清楚。同時，研究表明長鏈非編碼RNA(lncRNA)作為編碼蛋白的“失能”產物，從遺傳、轉錄和轉錄

2、后水平調控基因的表達，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用?；蚪M中某些轉錄位點既可轉錄編碼蛋白的mRNA也轉錄具有調控作用的lncRNA，而lncRNA往往能夠反饋調控同源蛋白編碼基因的表達。鑒于Sp1在胃癌發(fā)生過程中的重要作用，篩選與Sp1表達相關的lncRNA，圍繞Sp1與lncRNA之間的調控作用，探討兩者間相互作用對于胃癌細胞生物學的影響十分必要。
　　研究目的：
　　本研究以Sp1啟動子為研究對象，在其啟動子區(qū)檢測

3、突變發(fā)生情況，以建立突變與Sp1蛋白表達的相關性;通過查找數(shù)據(jù)庫并結合Sp1“過表達”和“干擾”策略，力圖在胃癌細胞中篩選出與Sp1表達密切相關的lncRNA，并探討lncRNA與Sp1之間的反饋調節(jié)作用對于胃癌細胞SGC7901增殖作用的影響。
　　研究方法：
　　首先在101例胃癌患者的病理組織進行抽提DNA并進行克隆測序，在12例胃癌病理樣本中檢測到Sp1基因啟動子區(qū)-684位C→T，-637位T→C和-617位T→G

4、三種類型突變，之后對病理樣本進行免疫組化并標化評分，對Sp1蛋白表達與突變之間相關性進行分析。之后以PGL-3熒光素酶報告質粒系統(tǒng)為工具，構建分別含有上述3個位點突變啟動子的報告質粒，轉染293細胞后通過檢測熒光素酶活性來反映含有突變位點的啟動子活性;接下來通過生物信息學分析上述突變位點是否與轉錄因子結合序列相關，并對突變位點與患者臨床病理特征及預后進行了綜合分析以探討兩者間聯(lián)系。
　　為探討Sp1表達異常的機制，我們通過數(shù)據(jù)庫篩

5、選出與腫瘤相關的lncRNA分子，并構建Sp1過表達質粒和干擾片段，在胃癌細胞中篩選與Sp1表達相關的lncRNA;接下來我們設計了針對lncRNA基因的小干擾RNA，在確認干擾效率的基礎上，探討lncRNA對于Sp1表達的影響;通過共轉染lncRNA的RNAi和熒光素酶報告質粒，我們初步探討了lncRNA與Sp1啟動子活性的相關性。最后我們通過CCK8、流式細胞術、細胞劃痕和Transwell等實驗分別探討了Sp1和lncRNA對胃癌

6、細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響
　　研究結果：
　　我們在12例胃癌病理樣本中檢測到Sp1基因啟動子區(qū)-684位C→T，-637位T→C和-617位T→G三種類型突變，發(fā)生頻率分別為3.96％(4例)，5.94％（6例）和1.98％(2例)，通過IHC檢測Sp1表達，采用Fisher精確概率法分析發(fā)現(xiàn)Sp1蛋白表達與突變之間相關性p＞0.05;熒光素酶報告基因實驗揭示含有-684位C→T和-617位T→G突變啟動子活性增強

7、(p＜0.05)，而-637位T→C突變啟動子活性與對照組相比未發(fā)生明顯變化(p=0.319＞0.05)，生物信息學分析提示上述三個突變位點并未位于既有/潛在的Sp1啟動子區(qū)的轉錄因子結合位點;而統(tǒng)計學分析表明突變位點與患者臨床病理特征及預后之間沒有相關性。
　　通過數(shù)據(jù)庫篩選并結合Sp1“過表達”和“干擾”策略，我們發(fā)現(xiàn)CDKN2B-AS1，H19，KCNQ1OT1，MIR31HG和XIST等5個lncRNA與Sp1表達呈負相關

8、;而干擾CDKN2B-AS1表達后Sp1的mRNA和蛋白水平均上升;熒光素酶報告實驗表明這一干擾效應能夠上調Sp1啟動子的活性，且該效應與突變發(fā)生與否無關。
　　胃癌細胞生物學研究中，Sp1過表達和干擾CDKN2B-AS1表達能促進胃癌SGC7901細胞的增殖，干擾Sp1表達使凋亡的胃癌細胞數(shù)量增加;而干擾CDKN2B-AS1對胃癌細胞凋亡、遷移和侵襲無明顯影響。
　　研究結論:
　　1.Sp1基因啟動子區(qū)檢測到的-6