cGMP的心肌保護(hù)作用及自噬在MIRI中的作用.pdf

1、第一部分:環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷的心肌雙重保護(hù)作用及其機(jī)制的探討
　　環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cyclic guanosine3’5’-monophosphate，cGMP）是細(xì)胞內(nèi)一種第二信使，是由可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶（soluble guanosine cyclase，sGC）和顆粒狀鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶（particulate guanylyl cyclase，pGC）催化GTP轉(zhuǎn)化而生成。作為一種重要的細(xì)胞內(nèi)信使物質(zhì)，cGMP有3個(gè)主要靶點(diǎn)：cGMP-依賴

2、的蛋白激酶或蛋白激酶G（proteinkinase G，PKG），cGMP-調(diào)節(jié)的cAMP磷酸二酯酶，以及cGMP控制的離子通道。其中，PKG被認(rèn)為是最重要的cGMP下游靶點(diǎn)。在生理?xiàng)l件下，PKG通過(guò)松弛平滑肌細(xì)胞、抑制內(nèi)皮細(xì)胞通透性、抑制血小板活化以及對(duì)心肌細(xì)胞的負(fù)性肌力作用保護(hù)心血管系統(tǒng)。最近有研究報(bào)道，cGMP/PKG信號(hào)途徑在缺血預(yù)處理和后處理的心臟保護(hù)機(jī)制中發(fā)揮重要作用。另有報(bào)道指出，磷酸二酯酶-5抑制劑西地那非（silden

3、afil，偉哥）通過(guò)增加cGMP的積聚激活PKG，進(jìn)而保護(hù)缺血/再灌注的心肌細(xì)胞。然而cGMP/PKG信號(hào)途徑保護(hù)心臟的具體機(jī)制尚不清楚。
　　目前研究認(rèn)為，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)移孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）的開(kāi)放是導(dǎo)致缺血/再灌注損傷的關(guān)鍵因素，抑制mPTP的開(kāi)放是許多心臟保護(hù)物質(zhì)抗缺血/再灌注損傷的共同機(jī)制。雖然有人提出，mPTP可能是cGMP/PKG信號(hào)途徑

4、引起心臟保護(hù)的最終靶點(diǎn)，但尚未被證實(shí)。糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase3β，GSK-3β）在心肌保護(hù)中也起非常重要的作用，其機(jī)制主要是通過(guò)Ser9位點(diǎn)的磷酸化抑制其活性，從而阻止mPTP的開(kāi)放并保護(hù)再灌注損傷的心肌。已有研究證明，西地那非通過(guò)PKG信號(hào)通路使心肌細(xì)胞GSK-3β失活。推測(cè)，cGMP很可能通過(guò)GSK-3β的失活抑制mPTP的開(kāi)放。磷脂酰肌醇三激酶（phosphoinositide3-ki

5、nase，PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)途徑抑制GSK-3β的活性，并有報(bào)道此途徑可能被西地那非激活。同樣可以設(shè)想，cGMP/PKG信號(hào)可能通過(guò)PI3K/Akt使GSK-3β失活。PI3K/Akt的激活雖對(duì)缺血預(yù)處理心臟起保護(hù)作用，但是過(guò)度的Akt活化可以誘發(fā)病理性心室重構(gòu)和心力衰竭。因此，探討cGMP對(duì)Akt活性的影響及其可能機(jī)制具有重要意義。
　　本實(shí)驗(yàn)利用 H9c2大鼠心肌細(xì)胞株，探討 cGMP的心臟保護(hù)作用是否通過(guò)G

6、SK-3β的失活并抑制 mPTP開(kāi)放而引起，并進(jìn)一步觀察 cGMP是否通過(guò)影響Akt的活性使GSK-3β失活。
　　為了探討cGMP能否使GSK-3β失活，本研究用cGMP類似物8-Br-cGMP（500μmol/L）處理H9c2細(xì)胞30 min，利用Western blotting方法觀察GSK-3βSer9位點(diǎn)磷酸化的情況。結(jié)果顯示，8-Br-cGMP明顯增加GSK-3β的磷酸化，表明cGMP能夠抑制GSK-3β的活性。因?yàn)镻

7、KG是cGMP的重要下游因子，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定 PKG的主要底物血管擴(kuò)張刺激磷蛋白（vasodilator-stimulated phosphoprotein，VASP）的磷酸化水平檢測(cè)了PKG的活性。結(jié)果顯示，8-Br-cGMP明顯增加VASP的磷酸化，提示8-Br-cGMP能夠激活PKG。cGMP抑制GSK-3β活性的效應(yīng)被特異性PKG抑制劑KT5823（10μmol/l）所逆轉(zhuǎn)，提示cGMP是通過(guò)PKG抑制GSK-3β的活性。進(jìn)一步

8、的實(shí)驗(yàn)顯示，8-Br-cGMP本身并不能明顯增強(qiáng)GSK-3β磷酸化，而必須和PKG Iα共同作用時(shí)才表現(xiàn)出增加GSK-3β磷酸化的作用，進(jìn)一步證實(shí)了cGMP通過(guò)PKG抑制GSK-3β的活性。同樣，8-Br-cGMP與PKG Iα的直接相互作用使純化GSK-3β的磷酸化明顯增加。以上結(jié)果表明cGMP通過(guò)PKG使GSK-3β失活。
　　為了探討cGMP能否阻止mPTP開(kāi)放，本實(shí)驗(yàn)利用激光共聚焦顯微鏡成像技術(shù)和熒光染色方法（四甲基羅丹明

9、乙酯tetramethyrhodamine ester，TMRE）測(cè)定了線粒體膜電位，以此判斷mPTP的開(kāi)放程度。結(jié)果顯示，cGMP明顯抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的TMRE熒光強(qiáng)度的減少，說(shuō)明cGMP能夠抑制mPTP的開(kāi)放。用激活型GSK-3β質(zhì)粒（GSK-3β-S9A）轉(zhuǎn)染細(xì)胞，使GSK-3β處于持續(xù)激活狀態(tài)后，cGMP沒(méi)能抑制TMRE熒光強(qiáng)度的減少。由于抑制GSK-3β的活性可阻止mPTP的開(kāi)放，此結(jié)果進(jìn)一步證明cGMP通過(guò)抑制GSK-3β活

10、性而阻止mPTP的開(kāi)放。
　　為了進(jìn)一步闡明 cGMP是否通過(guò)影響 Akt活性而使 GSK-3β失活，實(shí)驗(yàn)用Western blotting檢測(cè)了Akt Ser473位點(diǎn)的磷酸化。我們意外地發(fā)現(xiàn)，8-Br-cGMP不能增加Akt的磷酸化，反而使其減少，提示cGMP的積聚可迅速抑制Akt的活性。為了證實(shí)這一發(fā)現(xiàn)，我們進(jìn)一步檢測(cè)了非特異性磷酸二酯酶抑制劑異丁基甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX

11、，200μmol/L）能否模擬cGMP的這種作用而抑制Akt的磷酸化。結(jié)果表明，IBMX使Akt的磷酸化明顯減少，卻增強(qiáng)VASP的磷酸化，表明IBMX通過(guò)cGMP抑制Akt的活性。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，8-Br-cGMP也阻斷胰島素對(duì)Akt的磷酸化效應(yīng)，提示cGMP不僅抑制Akt基礎(chǔ)活性，也抑制配體誘發(fā)的Akt活化。因?yàn)锳kt的過(guò)度激活可導(dǎo)致心肌肥大和心力衰竭，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能提示，cGMP可防止心衰的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)cGMP對(duì)Akt

12、磷酸化的抑制作用不能被PKG的抑制劑KT5823所逆轉(zhuǎn)，并且PKG的RNA敲除亦不能影響cGMP對(duì)Akt磷酸化的抑制效應(yīng)，說(shuō)明雖然PKG作為cGMP的重要下游信號(hào)，通過(guò)使GSK-3β失活而阻止mPTP的開(kāi)放，但并不參與cGMP對(duì)Akt的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。
　　Thr308和Ser473位點(diǎn)的磷酸化使Akt活化，而絲/蘇氨酸蛋白激酶磷酸酶使這些殘基去磷酸化而導(dǎo)致Akt的失活。因此，我們探討了cGMP是否通過(guò)激活絲/蘇氨酸蛋白激酶磷酸酶而

13、使 Akt失活。結(jié)果顯示，絲/蘇氨酸蛋白激酶磷酸酶抑制劑Calyculin A（5nmol/L）使Akt Ser473位點(diǎn)磷酸化明顯增加，且此效應(yīng)被8-Br-cGMP所阻斷，提示cGMP能活化絲/蘇氨酸蛋白激酶磷酸酶，從而導(dǎo)致Akt失活。為了進(jìn)一步證實(shí)這一發(fā)現(xiàn)，我們利用比色法進(jìn)一步檢測(cè)了蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase2A，PP2A）的活性。結(jié)果顯示，8-Br-cGMP使PP2A活性明顯增加。這些結(jié)果均表明，cGM

14、P通過(guò)激活蛋白激酶磷酸酶尤其是PP2A而抑制Akt的活性。
　　小結(jié)：
　　1. cGMP通過(guò)PKG抑制GSK-3β的活性并阻止mPTP的開(kāi)放，從而保護(hù)心臟；
　　2. cGMP對(duì)Akt活性起負(fù)性調(diào)節(jié)作用；
　　3. cGMP抑制Akt的活性主要通過(guò)激活PP2A，而不是通過(guò)PKG信號(hào)通路；
　　4. cGMP對(duì)心肌的生存具有雙重調(diào)節(jié)作用。
　　第二部分:自噬在心肌缺血再灌注損傷中的作用及其機(jī)制研究

15、r>　　缺血性心臟?。╥schemic heart disease，IHD）是嚴(yán)重威脅人類健康的最常見(jiàn)疾病之一。IHD的基本病理生理過(guò)程是心肌缺血，在其治療過(guò)程中再灌注會(huì)引發(fā)缺血區(qū)功能障礙加重和結(jié)構(gòu)損傷，稱為再灌注損傷（reperfusion injury）。有效防治再灌注損傷已成為醫(yī)學(xué)界亟待解決的重要課題。再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，且尚未完全闡明。普遍認(rèn)為，自由基、鈣超載、心肌能量代謝障礙、炎性反應(yīng)與細(xì)胞凋亡等在再灌注損傷中起重要

16、作用。自噬（Autophagy）作用是廣泛存在于大部分真核細(xì)胞中的一種生命現(xiàn)象，是溶酶體對(duì)自身結(jié)構(gòu)的吞噬降解，它是細(xì)胞內(nèi)的再循環(huán)系統(tǒng)。細(xì)胞在基礎(chǔ)狀態(tài)下有自噬活動(dòng)，同時(shí)各種應(yīng)激如饑餓和低氧癥也可以誘發(fā)自噬。自噬是一種細(xì)胞生存機(jī)制，但在某些條件下也導(dǎo)致細(xì)胞死亡（自噬性死亡或Ⅱ型程序性死亡）。最近的研究表明，心肌缺血/再灌注時(shí)可誘發(fā)自噬，但其發(fā)生的時(shí)期和具體作用尚不清楚。弄清缺血/再灌注過(guò)程中自噬啟動(dòng)時(shí)期及強(qiáng)度的演變，對(duì)再灌注損傷的防治可能起

17、重要的指導(dǎo)作用。自噬的調(diào)控主要是由Ⅰ型和Ⅲ型磷酸肌醇三磷酸激酶（PI3K）來(lái)完成，其中Ⅰ型PI3K通過(guò)激活雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）來(lái)抑制自噬的發(fā)生，即負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)制；自噬的另一種調(diào)節(jié)方式為mTOR非依賴性調(diào)節(jié)機(jī)制，也稱為正性調(diào)節(jié)機(jī)制，是Ⅲ型PI3K通過(guò)增加Beclin l蛋白的表達(dá)而誘發(fā)。LC3是Atg8在哺乳動(dòng)物中的同源物，已被明確參與自噬過(guò)程。LC3有LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ

18、兩種亞型，其中LC3-Ⅰ是胞漿蛋白，LC3-Ⅱ定位于前自噬體和自噬體，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值是自噬體形成數(shù)量的重要標(biāo)志。了解心肌缺血/再灌注時(shí)自噬發(fā)生的調(diào)控機(jī)制，有助于認(rèn)識(shí)再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制，并有助于尋找治療再灌注損傷的有效方法。基于以上理論，本研究初步探討了心肌缺血/再灌注時(shí)自噬的發(fā)生時(shí)期、自噬在再灌注損傷中的具體作用以及其調(diào)控機(jī)制。
　　本實(shí)驗(yàn)首先用Langendorff裝置制備大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷模型，在缺血0

19、、10、20和30 min時(shí)和再灌注10、30、60和120 min時(shí)采集心臟組織標(biāo)本，用Western blotting方法檢測(cè)LC3蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，在缺血期LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值雖有增加趨勢(shì)，但與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，自噬活動(dòng)并沒(méi)有加強(qiáng)。而在再灌注期不同時(shí)間點(diǎn)自噬活動(dòng)均顯著加強(qiáng)，說(shuō)明自噬在心肌再灌注損傷中起一定作用。
　　為了進(jìn)一步探討自噬在再灌注損傷中的確切作用，本研究觀察了3-甲基腺嘌呤（3-methyla

20、denine，3-MA）和腺苷受體激動(dòng)劑（N-Ethylcarboxamidoadenosine，NECA）對(duì)自噬和心肌梗死的影響。3-MA為特異性自噬抑制劑，而NECA則為腺苷A2受體擬似劑，是公認(rèn)的心臟保護(hù)物質(zhì)。再灌注5 min之前開(kāi)始用3-MA和NECA進(jìn)行干預(yù)并持續(xù)35 min。于再灌注10、30、60和120 min時(shí)采集心臟組織標(biāo)本，用Western blotting檢測(cè)LC3蛋白的表達(dá)，以觀察3-MA和NECA對(duì)自噬的影響

21、。再灌注120 min結(jié)束后，TTC染色法測(cè)定心肌梗死面積以觀察兩種干預(yù)藥物對(duì)心肌梗死面積大小的影響，推測(cè)自噬在再灌注損傷中的具體作用。結(jié)果顯示，3-MA抑制再灌注損傷誘發(fā)的自噬，并減少心肌梗死面積，說(shuō)明自噬在心肌再灌注損傷中起有害作用。NECA既能抑制自噬，同時(shí)也減輕再灌注引起的心肌梗死。這說(shuō)明NECA抑制自噬活動(dòng)可能是其保護(hù)再灌注心臟的機(jī)制之一。
　　為了探討再灌注誘發(fā)自噬的機(jī)制，本研究用Western blotting方法分

22、別檢測(cè)了缺血期和再灌注期Beclin1和mTOR的活性。結(jié)果顯示，在缺血期和再灌注期，Beclin1蛋白的表達(dá)均沒(méi)有增加，反而出現(xiàn)了下降的趨勢(shì)。Beclin1是自噬正性調(diào)節(jié)機(jī)制中的關(guān)鍵基因，說(shuō)明在大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷模型中，自噬的發(fā)生并不主要依賴于其正性調(diào)節(jié)機(jī)制。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示，mTOR的活性在缺血期和再灌注期均降低，說(shuō)明負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)制的減弱可能是誘發(fā)自噬的原因。
　　小結(jié)：
　　1.在大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷模型