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文檔簡介
1、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)的異常增殖與凋亡是低氧肺動(dòng)脈高壓肺血管重建發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在此病理過程中,多種細(xì)胞因子、生長因子通過細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑將細(xì)胞外增殖信號傳至核內(nèi),在核內(nèi)調(diào)節(jié)基因表達(dá),啟動(dòng)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。然而在此過程中PASMC的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚未完全闡明。
Hedgehog(Hh)信號通路是與發(fā)育相關(guān)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在脊椎動(dòng)物Hedgehog主要有三個(gè)成員,包括Shh(Sonic hedgehog)、Ihh(I
2、ndian hedgehog)和Dhh(Deserthedgehog)。Patched(Ptc)和Smoothened(Smo)共同介導(dǎo)Hedgehog信號向胞內(nèi)的傳遞,在無Hedgehog情況下,Ptc抑制Smo,當(dāng)Hedgehog與Ptc結(jié)合后,則解除了其抑制作用,繼而Smo激活轉(zhuǎn)錄因子Gli,從而增強(qiáng)或抑制一系列Hh信號靶基因的轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生一系列細(xì)胞效應(yīng)。
Hh信號通路在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用,對于胚胎細(xì)胞的增殖、分化
3、起著極為關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用,如果此通路發(fā)生突變,會(huì)導(dǎo)致多種嚴(yán)重的先天發(fā)育缺陷。近年來發(fā)現(xiàn),Hh信號通路在成熟機(jī)體的多種生理病理過程中也發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。Shh缺陷的小鼠肺組織血管結(jié)構(gòu)存在障礙,而Shh過度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致血管形成過度。最近報(bào)道,生物機(jī)械應(yīng)力可降低大鼠血管平滑肌Hh信號通路主要分子的表達(dá),對動(dòng)脈血管重建具有顯著影響。因此,本研究使用人原代PASMC培養(yǎng)模型,觀察Hh信號通路主要分子在正常及低氧時(shí)的表達(dá)和活性變化,并通過特異性拮抗劑及
4、激活劑調(diào)節(jié)此通路的活化水平,觀察其對PASMC增殖、凋亡及細(xì)胞因子分泌等病理變化的影響,以闡明Hh信號通路在低氧肺血管重建中的作用及機(jī)制,從而為低氧肺動(dòng)脈高壓的防治提供理論依據(jù)和新的治療靶點(diǎn)。
方法:
1.購買并培養(yǎng)HPASMC細(xì)胞株,RT-PCR檢測正常HPASMC中Shh、Ptc-1和Gli-1基因mRNA表達(dá);Western blot法檢測以上蛋白表達(dá),免疫熒光法檢測Ptc-1與Gli-1蛋白在靜息狀態(tài)
5、下HPASMC的定位。Shh刺激實(shí)驗(yàn)觀察Hh信號通路的功能。
2.Real-time RT-PCR和Western blot檢測低氧條件下HPASMC中Shh與Ptc-1mRNA與蛋白表達(dá)變化,免疫熒光法檢測Gli-1細(xì)胞定位的變化。
3.不同時(shí)相點(diǎn)低氧處理HPASMC,Alamar Blue法和流式細(xì)胞儀檢測低氧條件下阻斷Hh信號通路對HPASMC細(xì)胞增殖、凋亡與細(xì)胞周期分布的變化。
4.EL
6、ISA法檢測cyclopamine阻斷Hh信號通路對低氧誘導(dǎo)的HPASMC分泌MCP-1及IL-6活性的影響。
5.Alamar Blue法檢測維生素D3對低氧誘導(dǎo)的HPASMC增殖的影響。Real-timeRT-PCR檢測維生素D3對低氧誘導(dǎo)的HPASMC中Gli-1基因mRNA的表達(dá)影響,免疫熒光法檢測Gli-1蛋白細(xì)胞定位的變化。
結(jié)果:
1.RT-PCR顯示HPASMC有Shh、Ptc-
7、1與Gli-1 mRNA表達(dá),免疫熒光檢測顯示Ptc-1表達(dá)在HPASMC細(xì)胞膜,而Gli-1在靜息HPASMC的胞漿而非胞核表達(dá);Western blot法均檢測到以上蛋白表達(dá)。Shh刺激可明顯促進(jìn)HPASMC增殖,并可被Hh通路特異性抑制劑cyclopamine阻斷。
2.實(shí)時(shí)定量RT-PCR與Western blot均顯示Shh與Ptc-1的mRNA和蛋白表達(dá)在低氧4h后升高,8h達(dá)到高峰,12h下降。低氧可誘導(dǎo)Gl
8、i-1蛋白的胞核聚集,并可被cyclopamine所阻斷。
3.HPASMC經(jīng)24h靜息處理后進(jìn)行常氧與低氧培養(yǎng),低氧顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖,其增殖效應(yīng)主要發(fā)生在低氧4h、8h與12h。Cyclopamine可明顯抑制此低氧誘導(dǎo)的增殖效應(yīng),并可明顯增加G0/G1期、減少S期與G2/M期細(xì)胞周期分布。Annexin-V染色法流式細(xì)胞儀檢測顯示,與常氧對照比較,低氧刺激后HPASMC凋亡明顯減少,而cyclopamine對凋亡具有明
9、顯促進(jìn)作用。
4.常氧對照HPASMC培養(yǎng)基上清中可檢測到IL-6活性,但無MCP-1分泌,低氧8h處理后二者活性均明顯增高,cyclopamine處理可明顯抑制二者分泌。
5.維生素D3可明顯抑制低氧誘導(dǎo)的HPASMC Gli-1mRNA的表達(dá)和蛋白的核內(nèi)聚集,同時(shí)對低氧誘導(dǎo)的HPASMC的增殖具有明顯抑制作用。
結(jié)論:
1.正常HPASMC有Hh信號通路主要分子的表達(dá),并對細(xì)胞
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