Sonic Hedgehog信號通路在肝細胞癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其機制.pdf

1、原發(fā)性肝細胞癌(以下簡稱肝癌)是人類常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居惡性腫瘤的第5位，全球每年有50萬以上新發(fā)病例，其惡性程度高，預(yù)后差，是腫瘤相關(guān)死亡的第3大原因。在我國，肝癌患者約占全世界肝癌總數(shù)的一半，每年約有11萬人死于肝癌，死亡率居惡性腫瘤的第2位。侵襲和轉(zhuǎn)移是肝癌的顯著特征，也是其預(yù)后差的主要原因，因此抑制肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是肝癌治療的重要策略。進一步闡明肝癌侵襲與轉(zhuǎn)移的分子機制有助于發(fā)現(xiàn)肝癌治療的新靶點，也有助于改善肝癌的預(yù)后。

2、
　　 Hedgehog(HH)信號通路在胚胎發(fā)育期間調(diào)控著多種細胞的分化和生長，對維持成熟器官內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及維持某些成熟器官中干細胞的功能也起著非常重要的作用。大量研究已表明異常激活的HH信號通路與基底細胞癌、髓母細胞瘤、小細胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌等多種人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年，研究也發(fā)現(xiàn)異常激活的Sonic Hedgehog(SHH)信號通路在肝癌的發(fā)生中起重要作用。而且，SHH信號通路在多種類

3、型細胞運動與遷移的控制及血管形成中發(fā)揮重要作用，在卵巢癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌等腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移中亦起重要作用。但是，SHH信號通路在肝細胞癌的侵襲與轉(zhuǎn)移中的作用目前尚不清楚。
　　 基底膜(BM)和細胞外基質(zhì)(ECM)是抵抗腫瘤細胞浸潤與轉(zhuǎn)移的生理屏障。因此，降解BM和ECM是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要步驟?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，尤其是MMP-2與MMP-9是降解ECM與BM的主要酶，與腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在肝癌

4、的侵襲與轉(zhuǎn)移中也起著十分重要的作用。
　　 磷脂酰肌醇(-3)激酶(PI3K)/AKT信號通路可通過調(diào)控MMP-9和/或MMP-2參與多種腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。而PI3K又是局部粘著斑激酶(FAK)的下游底物，F(xiàn)AK可通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路進而調(diào)節(jié)細胞的增殖、粘附等。此外，F(xiàn)AK也可通過調(diào)控MMP-2和/或MMP-9的表達參與多種腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。
　　 PI3K/AKT通路是SHH信號通路所必需，SHH信號可通過

5、激活PI3K/AKT通路促進骨髓源內(nèi)皮祖細胞、成肌細胞、成纖維細胞等的生長、分化。而在肝癌中SHH信號通路是否是通過調(diào)控FAK/AKT信號通路和MMP的表達而影響腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，目前尚不清楚。
　　 本課題首先通過體外實驗研究SHH信號通路被激活或抑制時肝癌細胞遷移和侵襲及MMP-2/9表達的變化，并探討SHH信號通路與FAK/AKT信號通路之間的交叉對話(cross-talk)，然后檢測SHH信號通路主要成分與FAK/AKT信

6、號通路關(guān)鍵成分、MMP-2/9在肝癌組織中的表達及相關(guān)性，力圖證實SHH信號通路在侵襲與轉(zhuǎn)移中的作用及其機制，從而進一步闡明肝癌侵襲與轉(zhuǎn)移的分子機制，可能為抗肝癌侵襲與轉(zhuǎn)移提供新的治療靶點，為肝癌預(yù)后判斷與改善提供新思路。
　　 第一部分 Sonic Hedgehog信號通路在肝細胞癌遷移和侵襲中的作用
　　 目的：
　　 探討Sonic Hedgehog(SHH)信號通路在肝癌細胞遷移和侵襲中的作用。
　

7、　 方法：
　　 肝癌SK-Hep1、SMMC-7721細胞用于本研究。應(yīng)用real-time PCR檢測肝癌SK-Hep1、SMMC-7721細胞中SHH、PTCH1、Smo、Gli-1 mRNA表達情況；應(yīng)用real-time PCR和Western-blot檢測細胞轉(zhuǎn)染Gli-1 siRNA后mRNA和蛋白的表達情況；應(yīng)用細胞粘附實驗檢測胞粘附能力；應(yīng)用劃痕實驗分析細胞運動能力；應(yīng)用Transwell遷移和侵襲實驗分別分

8、析細胞遷移和侵襲能力；應(yīng)用MTT法檢測細胞活力。
　　 結(jié)果：
　　 外源性重組SHH-N能呈劑量依賴性增加肝癌細胞粘附、運動、遷移和侵襲能力；SHH中和抗體或cyclopamine能呈劑量依賴性抑制肝癌細胞的粘附、運動、遷移和侵襲能力；Gli-1 siRNA能明顯下調(diào)肝癌細胞中Gli-1 mRNA和蛋白表達；Gli-1 siRNA也能明顯抑制肝癌細胞的粘附、運動、遷移和侵襲能力；但重組SHH-N、SHH中和抗體、cyc

9、lopamine及Gli-1 siRNA均不影響肝癌細胞生長。
　　 結(jié)論：
　　 SHH信號通路參與肝癌細胞的遷移和侵襲，且這種作用不依賴于其細胞毒性作用，提示SHH信號通路可能是肝癌的治療靶點。
　　 第二部分 Sonic Hedgehog信號通路促進肝細胞癌遷移侵襲的機制研究
　　 目的：
　　 研究Sonic Hedgehog(SHH)信號通路促進肝癌細胞遷移和侵襲的機制。
　　

10、方法：
　　 應(yīng)用real-time PCR檢測mRNA表達；應(yīng)用MMP明膠酶活性實驗分析MMP-2和MMP-9活性；利用Western-blot分析蛋白表達；通過FAK siRNA下調(diào)肝癌細胞FAK表達；應(yīng)用Transwell遷移和侵襲實驗分別分析細胞遷移和侵襲能力。
　　 結(jié)果：
　　 外源性重組SHH-N能呈劑量依賴性增加肝癌細胞MMP-2和MMP-9mRNA、蛋白表達及活性；而SHH中和抗體、cyclop

11、amine則呈劑量依賴性減少肝癌細胞MMP-2和MMP-9 mRNA、蛋白表達及活性。MMP抑制劑GM6001、MMP-2抗體、MMP-9抗體能抑制重組SHH-N所誘導(dǎo)的肝癌細胞遷移和侵襲。
　　 重組SHH-N、SHH中和抗體、cyclopamine均不影響肝癌細胞中TIMP-1和TIMP-2的表達。
　　 外源性重組SHH-N能呈劑量依賴性增加肝癌細胞中磷酸化AKT(Ser473)(p-AKT)蛋白表達；而SHH中和

12、抗體、cyclopamine能呈劑量依賴性減少肝癌細胞中p-AKT蛋白表達。但重組SHH-N、SHH中和抗體、cyclopamine均不影響肝癌細胞AKT蛋白表達。重組SHH-N誘導(dǎo)的肝癌細胞遷移和侵襲、MMP-2和MMP-9的表達及活性均能被PI3K特異性抑制劑LY294002明顯抑制。
　　 外源性重組SHH-N呈劑量依賴性增加肝癌細胞中磷酸化FAK(Tyr397)(p-FAK)蛋白表達；而SHH中和抗體、cyclopami

13、ne則呈劑量依賴性減少肝癌細胞中磷酸化p-FAK蛋白表達。但重組SHH-N、SHH中和抗體、cyclopamine均不影響肝癌細胞FAK蛋白表達。下調(diào)肝癌細胞中的FAK表達能明顯抑制重組SHH-N誘導(dǎo)的肝癌細胞遷移和侵襲、MMP-2和MMP-9的表達與活性及p-AKT表達。
　　 結(jié)論：
　　 SHH信號通路通過上調(diào)FAK/AKT信號通路介導(dǎo)的MMP-2和MMP-9表達和活性促進肝癌細胞遷移和侵襲。
　　 第三部

14、分 Sonic Hedgehog信號通路主要成分在肝細胞癌組織中的表達及其與FAK/AKT信號通路、MMP-2和MMP-9的相關(guān)性
　　 目的：
　　 研究Sonic Hedgehog(SHH)信號通路主要成分、FAK/AKT信號通路關(guān)鍵成分與MMP-2/9在肝細胞癌組織中的表達及其相關(guān)性。
　　 方法：
　　 收集2004年7月至2007年3月期間中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除的200例經(jīng)病理確診的肝細胞

15、癌及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，構(gòu)建組織芯片，應(yīng)用免疫組化染色檢測SHH、PTCH1、Smo、Gli-1、FAK、磷酸化FAK(Tyr397)(p-FAK)、磷酸化AKT(Ser473)(p-AKT)、MMP-2和MMP-9蛋白的表達；應(yīng)用reai-time PCR分析其中36例肝細胞癌組織與癌旁組織中的SHH、PTCH1、Smo、Gli-1、FAK、MMP-2和MMP-9 mRNA的表達。分析各指標(biāo)與肝癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。采用Spearma

16、n's相關(guān)檢驗分析肝細胞癌組織中各蛋白間的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 肝癌組織中SHH、PTCH1、Smo和Gli-1蛋白和mRNA表達水平均明顯高于相應(yīng)的癌旁組織；SHH、Smo、Gli-1過表達與肝癌TNM分期、血管侵犯及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；PTCH1與肝癌分化程度有關(guān)，而與腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移無關(guān)；FAKmRNA和蛋白、p-FAK蛋白在肝癌中表達明顯增高，且與肝癌包膜侵犯、較高的TNM分期、血管侵犯及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；肝

17、癌組織中p-AKT過表達與肝癌分化程度、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、血管侵犯、TNM分期及較高的Ki-67增殖指數(shù)密切相關(guān)；MMP-2和MMP-9在肝癌中的表達水平與肝硬化、包膜侵犯、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、血管侵犯和較高的TNM分期密切相關(guān)；肝癌組織中SHH和Gli-1蛋白表達均與p-FAK、p-AKT、MMP-2和MMP-9成正相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 SHH信號通路在肝癌組織中是激活的，并參與腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移；SHH信號通路與FAK/AKT通路及