Hedgehog信號通路在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制.pdf

1、研究背景：
　　 肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是我國高發(fā)的惡性腫瘤，其發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、死亡率都有增加趨勢。手術(shù)切除仍然是其最有效的治療，但是術(shù)后由于容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后仍較差，積極探討新的治療靶點(diǎn)具有重要的意義。Hedgehog（Hh）信號通路是高度保守的調(diào)控胚胎組織分化發(fā)育的通路，在脊柱動物體內(nèi)，Hh蛋白與跨膜受體Ptch結(jié)合后，解除了Ptch對Smo的抑制，隨后Smo從共受體上解離下來

2、進(jìn)入胞漿，將信號下傳并激活鋅指轉(zhuǎn)錄因子Gli，后者啟動Ptch-1、Hip、Gli1、Wnt等目的基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌、基底細(xì)胞癌、胰腺癌、結(jié)腸癌以及胃癌等眾多惡性腫瘤中Hh信號通路異常持續(xù)激活，通過阻斷該信號通路后，可以抑制腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。但是該信號在HCC發(fā)病機(jī)制中的作用尚不清楚。
　　 目的：
　　 探討Hh信號通路在原發(fā)性肝細(xì)胞癌形成過程中的作用及其可能機(jī)制。為進(jìn)一步

3、深入了解肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展過程并為其診斷和治療提供新的科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1. 構(gòu)建含有肝癌組織和相應(yīng)癌旁組織的組織芯片；
　　 2. 用免疫組織化學(xué)染色法檢測Shh、Ihh、Ptch-1和Gli-2的表達(dá)，并對表達(dá)情況與臨床病理組織學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系進(jìn)行分析；
　　 3. 采用RT-PCR方法檢測Hh信號通路各分子在5株肝細(xì)胞系（L02、HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Huh7）

4、中的表達(dá)情況；
　　 4. 選用Hh信號活性最強(qiáng)的人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721作為研究模型，使用不同濃度的Hh信號通路特異性抑制劑KAAD-cyclopamine處理細(xì)胞，采用MTT法檢測細(xì)胞增殖，BrdU摻入法結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測DNA合成情況和細(xì)胞周期；
　　 5. 采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，AnnexinⅤ/PI流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡率，Caspase-3活性檢測試劑盒檢測Caspase-

5、3活性；
　　 6. 采用細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞體外運(yùn)動和侵襲實(shí)驗(yàn)研究細(xì)胞粘附、運(yùn)動和侵襲；
　　 7. Western blot檢測CyclinD1、p21、caspase-3、bcl-2、E-cad等調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1. 成功構(gòu)建含有88個位點(diǎn)的組織芯片，44對肝癌和癌旁組織以一對一點(diǎn)陣方式排列，顯微鏡閱片證實(shí)取材正確，與原組織診斷吻合，結(jié)構(gòu)保存良好。
　　 2. HCC

6、組織中Hh信號通路活性較癌旁組織顯著增強(qiáng)。Shh、Ptch-1在HCC中的陽性表達(dá)率均高于癌旁肝組織（P＜0.05）；但二者的表達(dá)與各項(xiàng)臨床病理指標(biāo)，包括年齡、組織學(xué)分型、腫瘤大小、轉(zhuǎn)移以及HBV感染之間均無明顯關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。Ihh在兩種組織中的表達(dá)無明顯差異（P＞0.05），其表達(dá)與各種臨床病理參數(shù)無明顯關(guān)聯(lián)。Gli-2在HCC中的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁組織（P＜0.01）；且與組織學(xué)分型組以及腫瘤是否發(fā)上轉(zhuǎn)移相關(guān)。低分化和伴

7、有門靜脈轉(zhuǎn)移的病例中的表達(dá)率高于高分化組和無門靜脈轉(zhuǎn)移的腫瘤，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 3. Hh信號通路在5株肝細(xì)胞系中均有不同程度表達(dá)。其中Shh、Ptch-1、Smo、Gli-2的mRNA表達(dá)水平在肝癌細(xì)胞系中明顯增強(qiáng)，尤以SMMC-7721細(xì)胞為甚，而正常肝細(xì)胞系L02細(xì)胞中上述各分子的表達(dá)較弱。特別是Gli2在這兩種細(xì)胞中的差別更為明顯。Gli1在Hep3B和SMMC-7721細(xì)胞中表達(dá)水平也顯著升高

8、。而Ihh和Gli3在各種細(xì)胞系中表達(dá)均較弱。
　　 4. 應(yīng)用Hh信號通路特異性抑制劑KAAD-cyclopamine處理人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721后，細(xì)胞生長增殖能力顯著減弱，而且隨著KAAD-cyclopamine濃度的增加以及作用時間的延長，其抑制效果也相應(yīng)提高，呈現(xiàn)一定的劑量和時間依賴性。BrdU摻入法結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示KAAD-cyclopamine能顯著減少SMMC-7721細(xì)胞DNA合成，提高G0/G

9、1期細(xì)胞比例并降低S期細(xì)胞比例（P＜0.05）。同時，Western blot檢測結(jié)果顯示p21的蛋白表達(dá)水平明顯升高而CyclinD1的表達(dá)明顯降低。
　　 5. Hh信號通路阻斷后，SMMC7721細(xì)胞的生存能力下降，凋亡率明顯升高。干預(yù)后細(xì)胞由飽滿舒展、貼壁生長狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閳A鈍縮小、脫落懸浮狀態(tài)。Annexinⅴ/PI檢測結(jié)果顯示細(xì)胞早期凋亡顯著增加；TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)干預(yù)組細(xì)胞凋亡明顯增多，熒光顯微鏡下反光增強(qiáng)（P＜0.

10、01）。促凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)明顯上調(diào)而抗凋亡基因bcl-2的表達(dá)下調(diào)。
　　 6. KAAD-cyclopamine使SMMC-7721細(xì)胞的運(yùn)動侵襲能力顯著下降。劃痕愈合試驗(yàn)結(jié)果顯示，干預(yù)組細(xì)胞的愈合程度較對照降低了65%，細(xì)胞的運(yùn)動速度下降了約40%（P＜0.01）。細(xì)胞體外運(yùn)動能力和侵襲能力均受到明顯的抑制，與對照組相分別下降了54.4±7%和48.3±11.9%（P＜0.01）。Western blot檢測顯

11、示E-鈣粘蛋白的表達(dá)量隨著Hh信號阻斷而上調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 HCC組織中，Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路呈現(xiàn)高表達(dá)現(xiàn)象，并且與肝癌的分化和轉(zhuǎn)移之間存在明顯關(guān)聯(lián)，與此一致的是，在5株肝細(xì)胞系細(xì)胞中，惡性程度較高且具有較強(qiáng)侵襲能力的細(xì)胞株SMMC-7721中Hh信號通路的活性最強(qiáng)。利用KAAD-cyclopamine特異性阻斷SMMC-7721細(xì)胞中Hh通路后，可明顯抑制細(xì)胞DNA合成，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞生長增殖能力，其機(jī)制可能與促

12、進(jìn)p21的表達(dá)，抑制CyclinD1的表達(dá)有關(guān)。阻斷Hh通路后，可以降低細(xì)胞生存能力，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，原因可能與上調(diào)了凋亡促進(jìn)因子Caspase-3、下調(diào)了凋亡抑制因子bcl-2的表達(dá)有關(guān)。此外，Hh信號通路被阻斷后，肝癌細(xì)胞的運(yùn)動遷徙能力和侵襲力顯著降低，其機(jī)制可能與促進(jìn)E-鈣粘蛋白的表達(dá)有關(guān)。
　　 因此，Hh信號通路在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。參與了肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡以及侵襲轉(zhuǎn)移的多種生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)。對H