5-羥色胺對(duì)巨核細(xì)胞增殖和抗凋亡的作用及機(jī)理研究.pdf

1、背景與目的:血小板減少癥是臨床常見(jiàn)的體征,隨著化療及干細(xì)胞移植等腫瘤治療手段的發(fā)展,腫瘤患者的5年生存率大大提高,化療副作用和并發(fā)癥常常是導(dǎo)致患者死亡的原因,血小板減少癥就是重要的并發(fā)癥之一,其死亡率也比較高。目前迅速而有效的治療血小板減少癥的方法是行血小板輸注,但反復(fù)輸注血小板能誘生抗血小板抗體,導(dǎo)致血小板輸注無(wú)效,因此,血小板減少癥后期的治療往往十分棘手。如何迅速提升血小板數(shù)目又避免抗體產(chǎn)生等不良作用已成為目前臨床亟待解決的問(wèn)題。近

2、年來(lái)相繼發(fā)現(xiàn)了粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)等細(xì)胞因子,較好的解決了粒細(xì)胞缺乏和貧血等問(wèn)題,也為血小板減少癥的治療開(kāi)辟了新的途徑。1994年成功分離了促血小板生成素(thrombopoietin,TPO),但是誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生和激活血小板等不良反應(yīng)一直限制了其在臨床上的應(yīng)用,并且臨床效果也不及先前的預(yù)料,鑒于巨核細(xì)胞增殖分化和血小板生成是一個(gè)比較特殊的生理過(guò)程,發(fā)現(xiàn)一個(gè)

3、新的物質(zhì)來(lái)代替或者輔助 TPO,以快速提高循環(huán)血小板的數(shù)量來(lái)滿足臨床需要,就顯得特別重要。
　　5-羥色胺(血清素,5-Hydroxtryptamine,5-HT)是一種吲哚胺,作為神經(jīng)遞質(zhì)和血管活性物質(zhì),在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)及外周器官起著重要的生理功能。1986年 Nemecek等首先報(bào)道5-HT對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用,此后的研究證實(shí)血清素也是一種生長(zhǎng)因子,對(duì)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖有促進(jìn)作用。由于5-HT不能透過(guò)血腦屏障

4、,所以外周和中樞的5-HT分屬兩個(gè)不同的系統(tǒng),血液循環(huán)中的5-HT約98％貯存于血小板的致密顆粒中,是血小板顆粒的重要成分,在止血過(guò)程中為活化的血小板所釋放,引起血管收縮和血小板聚集,因此,在止血過(guò)程中有重要作用,和巨核細(xì)胞-血小板系統(tǒng)也有十分密切的關(guān)系。1996年, Yang等首次報(bào)道了5-HT對(duì)巨核細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用,其后,他們證明人巨核系祖細(xì)胞,巨核細(xì)胞以及主要的巨核細(xì)胞株 Meg-01、M-07e、CHRF-288均有5-HT2

5、A、5-HT2B和5-HT2C三種受體亞型表達(dá);巨核細(xì)胞能夠攝取5-HT,但儲(chǔ)存功能并不完善。我們推測(cè)5-HT是一種潛在的促血小板生成因子,值得進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)5-HT對(duì)巨核細(xì)胞的增殖和凋亡的影響,來(lái)探討5-HT促進(jìn)血小板生成的機(jī)制。
　　方法:巨核細(xì)胞產(chǎn)生血小板過(guò)程可能是一個(gè)凋亡的過(guò)程,凋亡在巨核細(xì)增殖和血小板形成過(guò)程有重要意義。本研究主要包括驗(yàn)證5-HT促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖和探索血清素在巨核細(xì)胞凋亡的作用兩個(gè)部分,以及對(duì)

6、上述現(xiàn)象機(jī)理的初步研究。本研究采用倒置顯微鏡和MTT法觀察5-HT對(duì)巨核細(xì)胞增殖的影響,采用流式細(xì)胞儀研究5-HT作用下細(xì)胞周期的變化,以及通過(guò)檢測(cè) Annexin V, Caspase-3,JC-1等研究5-HT在巨核細(xì)胞凋亡過(guò)程的作用及5-HT2受體拮抗劑Kentaserin對(duì)其作用的影響。最后運(yùn)用 Western Blot法初步研究5-HT處理后細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵激酶的變化。
　　結(jié)果:在倒置顯微鏡下,5-HT組 Meg-01和M-

7、07e細(xì)胞密度均明顯高于對(duì)照組,細(xì)胞計(jì)數(shù) M-07e細(xì)胞,5-HT組和對(duì)照組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。MTT法對(duì)細(xì)胞增殖定量研究,結(jié)果顯示濃度為50nmol/l時(shí)5-HT開(kāi)始對(duì) Meg-01細(xì)胞增殖有刺激作用(P<0.05),200nmol/l時(shí)達(dá)到最大效應(yīng)(P<0.01)。細(xì)胞周期研究中,200nmol/l5-HT組細(xì)胞 S/G2/M期比例(53.87%)高于對(duì)照組(26.06%),兩組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.049

8、)。流式細(xì)胞儀檢測(cè) Annexin V, JC-1, Caspase-3以及檢測(cè)前的臺(tái)盼藍(lán)染色均提示5-HT組的細(xì)胞凋亡率均和死亡率低于對(duì)照組,差別有顯著性(P<0.05),其中, Annexin V檢測(cè)5-HT組細(xì)胞早期凋亡率(7.47%)和對(duì)照組(21.38%)比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),5-HT組和5-HT+ Kentaserin組比較,早期凋亡率有顯著性差異(P<0.05),而 Kentaserin組和對(duì)照組比較,差別

9、無(wú)顯著性(P>0.05);5-HT組細(xì)胞的活化 Caspase-3表達(dá)和單體JC-1均有所下降,和對(duì)照組比較,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western blot法檢測(cè)Akt和Erk激酶結(jié)果初步顯示,各組的總Akt、 Erk條帶大小粗細(xì)相當(dāng),和對(duì)照組比較經(jīng)5-HT處理的各組和TPO組均出現(xiàn)比較明顯的磷酸化 Akt(p-Akt)、磷酸化 Erk(p- Erk)條帶,并且 p-Erk條帶在5-HT+Kentaserin組明顯減弱。