β淀粉樣蛋白致海馬神經(jīng)元損傷機(jī)制以及烏雞白鳳丸有效成分的神經(jīng)保護(hù)作用.pdf

1、老年性癡呆(Alzheimers'sseaseAD)是一種危害嚴(yán)重的神經(jīng)退行性疾病，典型的病理改變之一是病變腦區(qū)中存在大量的老年斑，其主要成分是β淀粉樣蛋白(amyloidbeta-protein，Aβ)。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為：Aβ在腦組織中的積聚是各種原因誘發(fā)AD的共同通路，也是AD形成和發(fā)生的關(guān)鍵因素。現(xiàn)在的研究結(jié)果表明：Aβ的異常沉積可以啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)多種蛋白參與的系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)神經(jīng)毒性，損傷神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致患者出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙。但究竟

2、有哪些已知或者是未知的蛋白和酶參與了Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)毒性損傷，以及這些蛋白分子之間的相互作用和調(diào)控機(jī)制，目前尚均未能完全闡明。 為深入探討Aβ神經(jīng)毒性作用的機(jī)制及其主要的靶位分子，本研究選用不同濃度(0.1、1、10、20、30μmol/L)老化的Aβ1-40誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的原代海馬神經(jīng)元，MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞的存活率，選擇Aβ1-40的合適濃度建立AD損傷的神經(jīng)細(xì)胞模型。利用SELDI-TOF技術(shù)與蛋白質(zhì)芯片技術(shù)相結(jié)合，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)液

3、中蛋白質(zhì)的表達(dá)，尋找與Aβ1-40誘導(dǎo)相關(guān)的表達(dá)差異蛋白。在Swiss蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索差異蛋白的相關(guān)信息，初步確定蛋白的性質(zhì)。利用半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)海馬神經(jīng)元模型中差異蛋白在mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化，從基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平同時(shí)驗(yàn)證Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)變化。通過(guò)文獻(xiàn)檢索，分析Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)變化參與Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性和細(xì)胞損傷之間的可能通路。再重復(fù)相同的實(shí)驗(yàn)條件，檢測(cè)Aβ1-40誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元是否

4、表現(xiàn)出該通路的開(kāi)啟或加強(qiáng)，同時(shí)也給予已證實(shí)有效神經(jīng)保護(hù)劑量的類(lèi)雌激素藥物烏雞白鳳丸(BakFoongPills，BFP)進(jìn)行干預(yù)，并觀察該通路的變化。本研究還檢測(cè)了AD細(xì)胞模型中載脂蛋白E(apoE)和載脂蛋白E受體相關(guān)蛋白(LRP)的表達(dá)，并探討了兩者相互作用對(duì)清除培養(yǎng)基中外源性Aβ1-40的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明： 1.10μmol/L的Aβ1-40對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元有明顯的毒性作用(P＜0.01)，1μmol/L的Aβ

5、1-40對(duì)細(xì)胞的毒性較弱(P＜0.05)。選擇這兩種濃度的Aβ1-40與海馬神經(jīng)元共孵育建立AD的細(xì)胞模型。 2.比較Aβ1-40孵育前后神經(jīng)元的蛋白質(zhì)圖譜，在4000～20000Da范圍內(nèi)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Aβ1-40誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)特異性的蛋白質(zhì)。蛋白圖譜中所見(jiàn)的差異僅體現(xiàn)在蛋白表達(dá)水平的變化，其中有9個(gè)蛋白峰的表達(dá)有顯著差異(P＜0.01)。 3.在Swiss蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，分子量為18567Da的差異蛋白分子與大鼠S期激酶

6、相關(guān)蛋白SKP1A“S-phasekinase-associatedprotein1A(CyclinA/CDK2-associatedproteinp19)”的分子量和等電點(diǎn)接近，該蛋白峰僅在10μmol/LAβ1-40誘導(dǎo)的神經(jīng)元中高表達(dá)。 4.半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)元中SKP1AmRNA表達(dá)的結(jié)果顯示：給予10μmol/LAβ1-403h后，海馬神經(jīng)元SKP1AmRNA增高，該趨勢(shì)可持續(xù)至48h；1μmol/LAβ1

7、-40對(duì)SKP1A表達(dá)的影響較短暫，只在3h出現(xiàn)一過(guò)性增高。 5.10μmol/LAβ1-40作用于海馬神經(jīng)元24h后，可以下調(diào)bcl-2基因表達(dá)，上調(diào)bax基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)bcl-2/bax的比值降低，增強(qiáng)caspase-3基因的表達(dá)，原位末端標(biāo)記(TUNEL法)檢測(cè)結(jié)果提示海馬神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡。 6.給予了已經(jīng)證實(shí)有效神經(jīng)保護(hù)劑量的BFP(100μg/ml)進(jìn)行干預(yù)后，有效抑制了10μmol/LAβ1-40誘導(dǎo)的海

8、馬神經(jīng)元的凋亡，部分拮抗了bcl-2基因表達(dá)變化(P＜0.05)，對(duì)bax表達(dá)的變化無(wú)顯著影響，提高了bcl-2/bax的比值，caspase-3基因的表達(dá)降低。 7.加入1μmol/LAβ1-40作用24h，神經(jīng)元內(nèi)apoE和LRP的表達(dá)均上調(diào)，培養(yǎng)基中的外源性Aβ1-40的濃度降低；加入10μmol/LAβ1-40共孵育，神經(jīng)元內(nèi)apoE的表達(dá)以下調(diào)為主，而LRP的表達(dá)仍為上調(diào)，培養(yǎng)基中的外源性Aβ1-40的濃度沒(méi)有明顯變化

9、。 綜上所述：本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)和分子生物學(xué)的研究技術(shù)和手段，研究了Aβ在海馬神經(jīng)元外過(guò)度沉積所引的細(xì)胞內(nèi)多種蛋白的異常表達(dá)，其中與調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白分子SKP1A在毒性劑量Aβ的作用下持續(xù)高表達(dá)，與cyclinA在內(nèi)的多種分子共同作用，導(dǎo)致體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞周期紊亂，凋亡調(diào)控基因bcl-2/bax的比例失調(diào)、激活了caspase-3相關(guān)的凋亡途徑，導(dǎo)致神經(jīng)元()凋亡，表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，是Aβ?lián)p傷神經(jīng)系統(tǒng)的機(jī)理之

10、一。烏雞白鳳丸具有神經(jīng)保護(hù)作用，可通過(guò)調(diào)控bcl-2/bax的比值、降低caspase-3基因的表達(dá)，來(lái)阻斷Aβ所誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡。 第一章：利用SELDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)尋找與Aβ致海馬神經(jīng)元損傷相關(guān)的蛋白質(zhì)摘要目的：利用基于表面增強(qiáng)的激光解析電離(SurfaceEnhancedLaserDesorption/IonizationSELDI)技術(shù)的時(shí)間飛行質(zhì)譜儀(SELDI-TOF-MS)，檢測(cè)體外培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元在加

11、入Aβ作用后細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，尋找與Aβ?lián)p傷相關(guān)的一組蛋白，為進(jìn)一步探討這組蛋白導(dǎo)致神經(jīng)元毒性的作用機(jī)理提供理論依據(jù)。材料和方法：體外原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元，MTT法檢測(cè)0.1、1、10、20、30μmol/LAβ1-40的毒性作用，選擇高毒性劑量和低毒性劑量的Aβ1-40，分別作用于細(xì)胞24h后，加入裂解液裂解細(xì)胞，抽提細(xì)胞內(nèi)的蛋白，與WCX2蛋白質(zhì)芯片相互作用，利用SELDI-TOF技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)液中分子量在4000～2000

12、0Da范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，繪制出蛋白表達(dá)圖譜，在BiomarkerWizard軟件的輔助下，分析差異蛋白。根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)，在Swiss蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)差異蛋白進(jìn)行初步鑒定。 結(jié)果：10μmol/L的Aβ1-40有明顯細(xì)胞毒作用(P＜0.01)，1μmol/L的Aβ1-40對(duì)細(xì)胞的毒性較弱(P＜0.05)。比較Aβ1-40孵育前后神經(jīng)元的蛋白質(zhì)圖譜，在4000～20000Da范圍內(nèi)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Aβ1-40誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)特

13、異性的蛋白質(zhì)。蛋白圖譜中所見(jiàn)的差異僅體現(xiàn)在蛋白表達(dá)水平的變化。有9個(gè)蛋白峰的表達(dá)有顯著差異(P＜0.01)，按照兩種不同濃度Aβ1-40對(duì)其調(diào)節(jié)水平的不同可分成4組： (1)1μmol/L和10μmol/LAβ1-40均誘導(dǎo)其表達(dá)上調(diào)的有：7891和7997Da的一組分子量相近的蛋白質(zhì) (2)只有10μmol/LAβ1-40誘導(dǎo)其表達(dá)上調(diào)的有18567和18672Da的一組分子量相近的蛋白質(zhì) (3)10μmol/

14、LAβ1-40誘導(dǎo)其表達(dá)上調(diào)，而1μmol/LAβ1-40誘導(dǎo)其表達(dá)下調(diào)的有分子量為7549和18329Da的蛋白質(zhì) (4)1μmol/L和10μmol/LAβ1-40均誘導(dǎo)其表達(dá)下調(diào)的有分子量為4496、6593和8886Da的一組蛋白質(zhì) 在Swiss蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到其中分子量18567Da的蛋白與大鼠“S-phasekinase-associatedprotein1A(CyclinA/CDK2-associated