ALDH2在β淀粉樣蛋白致神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、隨著全球進(jìn)入老齡化社會(huì)的進(jìn)程加快，阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)這一嚴(yán)重威脅老年人體健康的神經(jīng)退行性疾病發(fā)病率、病死率也呈逐年上升的態(tài)勢，給社會(huì)和家庭造成沉重負(fù)擔(dān)。然而，臨床上對(duì)AD的有效治療手段十分欠缺，療效很有限。究其原因，主要是缺乏對(duì)AD發(fā)病機(jī)制的深入理解和針對(duì)其治療靶點(diǎn)的新型治療劑。
　　β淀粉樣蛋白（Aβ）是AD神經(jīng)元病理改變神經(jīng)炎性斑塊的主要組成成分和元兇。在腦內(nèi)由淀粉樣前體蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的

2、β-裂解酶作用下生成。目前的研究認(rèn)為,腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外重要細(xì)胞器如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Aβ沉積和腦內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)膜Aβ沉積可能是AD致病的核心機(jī)制，Aβ已成為治療AD的重要靶點(diǎn)之一。
　　線粒體乙醛脫氫酶2（ALDH2），是乙醛脫氫酶家族中的一員，是核編碼的線粒體酶，進(jìn)化保守，在機(jī)體各個(gè)器官廣泛表達(dá)。其主要功能為將酒精代謝過程中產(chǎn)生的乙醛脫氫生成乙酸，從而降低許多酒精相關(guān)性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。其次，ALDH2具有硝酸鹽還原酶的作用，能將硝酸酯類

3、藥物轉(zhuǎn)化為具有生物活性的一氧化氮，以此降低冠心病死亡風(fēng)險(xiǎn)。更為重要的是，近年的研究發(fā)現(xiàn)，ALDH2因其能夠直接、間接轉(zhuǎn)化機(jī)體各組織器官、細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的細(xì)胞毒性反應(yīng)性醛類等物質(zhì)，具有顯著的細(xì)胞保護(hù)作用，且與多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病發(fā)病相關(guān)。國內(nèi)外流行病學(xué)調(diào)查研究結(jié)果亦顯示，ALDH2基因缺失型人群阿爾茨海默病患病率明顯增高；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ALDH2基因敲除小鼠更易遭受氧化應(yīng)激損傷，表現(xiàn)出增齡相關(guān)性神經(jīng)退行性病理改變及記憶力喪失等一

4、系列神經(jīng)功能障礙；細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)顯示，在原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中過表達(dá)A LD H2可有效減少代謝產(chǎn)物4羥基壬荃導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)及線粒體損傷。然而，AL D H2在Aβ所致的神經(jīng)元損傷中起到什么作用?其機(jī)制是什么？既然 ALDH2突變能增加患 AD的危險(xiǎn)性，使用ALDH2激活劑Alda-1是否能夠保護(hù)Aβ所致的神經(jīng)元損傷？目前未見相關(guān)報(bào)道。
　　研究目的：探索ALDH2在AD神經(jīng)元病理損傷中的作用，并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。

5、為其作為AD病因治療嶄新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究方法：使用聚集態(tài)的Aβ50?mol/L處理HT22細(xì)胞即小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系，構(gòu)建AD細(xì)胞模型，并在此基礎(chǔ)上使用ALDH2特異性激活劑Alda-1，ALDH2特異性抑制劑Daidzin。以MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞生存率、流式細(xì)胞術(shù)及Tunel檢測細(xì)胞凋亡率。Western-bolt檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase3、Bcl2等。原代神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化AD細(xì)胞模型上進(jìn)行干預(yù)，經(jīng)10％胎

6、牛血清誘導(dǎo)分化5天后加入Aβ25-3550?mol/L、ALDH2激活劑Alda-150?mol/L、ALDH2抑制劑Daidzin60?mol/L，觀察分化的克隆球形態(tài)和神經(jīng)元數(shù)目，進(jìn)一步證明AL DH2神經(jīng)元保護(hù)作用。使用透射電鏡檢測細(xì)胞線粒體形態(tài)、超氧陰離子熒光探針檢測 ROS水平、Elisa檢測4-HN E水平、熒光素酶法檢測細(xì)胞內(nèi)ATP含量。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果： MTT實(shí)驗(yàn)顯示Aβ50?mo l/L處理24小時(shí)后細(xì)胞生存率顯

7、著降低。在Aβ所致AD細(xì)胞模型基礎(chǔ)上加入ALDH2激活劑Alda-1,ALDH2抑制劑Daidzin。結(jié)果顯示：加入Alda-150?mol/L時(shí)細(xì)胞生存率明顯上升，而使用Daidzin60?mol/L時(shí)抑制AL DH2活性細(xì)胞生存率明顯下降，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示與Aβ處理組相比加入 ALDH2激活劑 Alda-150?mol/L后細(xì)胞凋亡率明顯降低，使用 ALDH2抑制劑Daidzin后細(xì)胞凋亡率無明顯變化。Western-bolt結(jié)果

8、顯示加入ALDH2激活劑Alda-150?mol/L后細(xì)胞內(nèi)Caspase3 active含量顯著減少，Bcl2含量顯著增加，與Aβ處理組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Tunel染色后熒光顯微鏡觀察加入Alda-1后綠色熒光標(biāo)記的凋亡細(xì)胞明顯減少。
　　原代小鼠神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Aβ處理組分化的克隆球形態(tài)異常、細(xì)胞數(shù)目減少。而ALDH2激活后分化克隆球形態(tài)較為正常，細(xì)胞數(shù)目增多。
　　透射電鏡結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，A

9、β處理組的線粒體存在空泡以及膜破裂而加入Alda-1后線粒體形態(tài)基本恢復(fù)正常。使用DHE熒光探針檢測了細(xì)胞內(nèi)ROS含量，結(jié)果顯示與Aβ處理組加入ALDH2激活劑Alda—1后 ROS熒光強(qiáng)度呈顯著下降。Elisa檢測4-HN E水平，與Aβ處理組相比加入ALDH2激活劑Alda—1后能顯著減少細(xì)胞內(nèi)4-HN E含量。使用熒光素酶法檢測細(xì)胞內(nèi)的ATP含量，與Aβ處理組相比加入ALDH2激活劑Alda—1后細(xì)胞內(nèi)ATP顯著升高。
　　

10、綜上所述 ALDH2激活能保護(hù)神經(jīng)元免受 Aβ所致?lián)p傷，其可能的機(jī)制為：AL DH2可減輕 Aβ的線粒體毒性作用，減少 RO S、4-HN E的產(chǎn)生，增加線粒體內(nèi)的ATP含量。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　1. Alda-1激活A(yù)LDH2能減輕Aβ所致的HT22細(xì)胞生存率降低，Caspase3表達(dá)的減少、Bcl2的表達(dá)增加，提示ALDH2保護(hù)Aβ所致的神經(jīng)元損傷。
　　2.神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化在模擬腦內(nèi)AD細(xì)胞環(huán)境下，Aβ所致的