人參皂甙Rb1對β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的:阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是發(fā)生在老年人的一種以漸進(jìn)性認(rèn)知能力障礙為主的神經(jīng)退行性疾病。隨著人類社會進(jìn)入老齡化，AD的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，每年65-85歲的人中約有5％-8％成為AD患者，AD病已經(jīng)成為一個(gè)很嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)和社會問題。由于缺乏有效的治療手段，AD病已成為危害人類健康的主要致死性疾病之一。AD的典型病理特征包括：β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)在腦內(nèi)沉積形成老年斑(senil

2、e plaques，SP)；神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)；神經(jīng)元的凋亡與丟失。神經(jīng)元凋亡是最終導(dǎo)致神經(jīng)元丟失的重要因素。眾所周知，Aβ的腦內(nèi)異常沉積是AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素。越來越多的研究表明：Aβ異常沉積可以誘發(fā)細(xì)胞氧化應(yīng)激，啟動細(xì)胞內(nèi)多種蛋白參與凋亡信號級聯(lián)反應(yīng)，造成神經(jīng)元的凋亡與丟失，導(dǎo)致患者出現(xiàn)漸進(jìn)性認(rèn)知功能障礙。但究竟有哪些已知或未知的蛋白參與了Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，以及這

3、些蛋白分子之間的相互作用和調(diào)控機(jī)制，目前尚未能完全闡明。因此，進(jìn)一步研究Aβ致神經(jīng)元凋亡的機(jī)制和尋找到抑制Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的藥物則非常重要。
　　 人參皂甙Rb1(GSRb1)是人參皂甙26個(gè)單體之一，占人參提取物的0.37-0.5％。研究表明人參皂甙Rb1能夠進(jìn)入血腦屏障，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有很強(qiáng)的藥理作用，但詳細(xì)的作用機(jī)制還有待闡明。本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)擬采用側(cè)腦室立體定位注射Aβ25-35建立Aβ大鼠模型，同時(shí)給予人參皂甙Rb1

4、進(jìn)行干預(yù)，觀察人參皂甙Rb1對Aβ模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響，觀察人參皂甙Rb1對Aβ模型大鼠海馬結(jié)構(gòu)SOD、GSH-PX及MDA的影響，觀察人參皂甙Rb1對Aβ模型大鼠海馬結(jié)構(gòu)神經(jīng)元Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)的影響；體外實(shí)驗(yàn)擬采用Aβ25-35誘導(dǎo)損傷PC12細(xì)胞建立神經(jīng)元模型，觀察人參皂甙Rb1對Aβ25-35誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞ROS相對熒光強(qiáng)度、細(xì)胞的p-P38/P38、p-ER

5、K/ERK、p-JNK/JNK蛋白表達(dá)的影響；探討人參皂甙Rb1對神經(jīng)元的保護(hù)作用及機(jī)制，為AD病的防治提供科學(xué)依據(jù)。
　　 材料與方法:
　　 1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　 (1)實(shí)驗(yàn)動物及分組：鼠齡12周的SD雄性大鼠60只，隨機(jī)分為GSRb1小劑量治療組(5mg/kg/d)、GSRb1中劑量治療組(10mg/kg/d)、GSRb1大劑量治療組(20mg/kg/d)、模型組、假手術(shù)對照組和正常對照組，每組10只。采用大

6、鼠側(cè)腦室立體定位注射老化的Aβ25-3510μg建立Aβ大鼠模型。造模后第3天各治療組腹腔注射不同劑量GSRb1，連續(xù)四周后檢測各項(xiàng)指標(biāo)。
　　 (2)采用Morris水迷宮測試大鼠逃避潛伏期和通過原平臺次數(shù)以檢測大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的變化。
　　 (3)采用生物化學(xué)方法檢測各組大鼠海馬結(jié)構(gòu)SOD和GSH-PX活性、MDA的含量。
　　 (4)采用Western blotting方法檢測各組大鼠海馬結(jié)構(gòu)Bcl-2

7、、Bax的蛋白表達(dá)。
　　 (5)采用免疫組織化學(xué)方法觀察各組大鼠海馬結(jié)構(gòu)Caspase-3陽性細(xì)胞的分布和表達(dá)。
　　 2、體外實(shí)驗(yàn)
　　 (1)細(xì)胞培養(yǎng)及分組：選用PC12細(xì)胞株，培養(yǎng)基為RPMI-1640，內(nèi)含10％胎牛血清，5％馬血清，青霉素100U/ml，鏈霉素100U/ml，置37℃，5％C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞分為GSRb1小劑量治療組(PC12+Aβ+0.01mM GSRb1)、GSRb1中劑

8、量治療組(PC12+Aβ+0.1mMGSRb1)、GSRb1大劑量治療組(PC12+Aβ+1mM GSRb1)、模型組(PC12+Aβ)、對照組(PC12細(xì)胞)。給藥24h后進(jìn)行下列檢測。
　　 (2)采用MTT比色法檢測各組細(xì)胞的存活率。
　　 (3)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡百分率。
　　 (4)采用熒光分光光度計(jì)檢測各組細(xì)胞ROS相對熒光強(qiáng)度。
　　 (5)采用Western blotting

9、方法檢測各組細(xì)胞的p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK蛋白表達(dá)。
　　 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，單因素方差分析進(jìn)行組間比較，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 (1)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：模型組大鼠在定位航行試驗(yàn)中平均逃避潛伏期較對照

10、組顯著延長，空間探索試驗(yàn)中跨越原平臺位置次數(shù)明顯減少(P＜0.01)。GSRb1各劑量組平均逃避潛伏期較模型組明顯縮短(P＜0.05)，跨越原平臺位置次數(shù)明顯增加(P＜0.05)，與對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 (2)生化檢測結(jié)果顯示：模型組大鼠海馬結(jié)構(gòu)SOD活性(58.73±2.67U/mg)較正常對照組(85.64±3.12U/mg)和假手術(shù)對照組(86.39±2.35U/mg)明顯降低(P＜0.05)，而

11、這種降低可被GSRb中、大劑量組(73.64±3.21U/mg、78.42±2.89U/mg)所抑制(P＜0.05)。模組大鼠海馬結(jié)構(gòu)MDA含量(6.81±0.45nmol/mg)較正常對照組(4.53±0.35nmol/mg)和假手術(shù)對照組(4.43±0.36nmol/mg)明顯升高(P＜0.05)，而這種升高可被GSRb1中、大劑量組(5.53±0.67nmol/mg、4.93±0.12nmol/mg)所抑制(P＜0.05)。模型組

12、大鼠海馬結(jié)構(gòu)GSH-PX活性(4.81±0.45U/mg)較正常對照組(7.53±0.66U/mg)和假手術(shù)對照組(7.43±0.36U/mg)明顯降低(P＜0.05)，而這種降低可被GSRb1中、大劑量組(6.73±0.71U/mg、6.93±0.79U/mg)所抑制(P＜0.05)。
　　 (3)Western blotting結(jié)果顯示：模型組大鼠海馬結(jié)構(gòu)Bcl-2蛋白表達(dá)相對值較對照組顯著降低(P＜0.01)，而GSRb1

13、小、中、大各劑量組可上調(diào)Bcl-2的表達(dá)(P＜0.05)；模型組大鼠海馬結(jié)構(gòu)Bax蛋白表達(dá)相對值較對照組顯著增高(P＜0.01)，而GSRb1小、中、大各劑量組可下調(diào)Bax的表達(dá)(P＜0.05)。
　　 (4)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：Caspase-3陽性反應(yīng)產(chǎn)物均呈棕黃色或棕褐色細(xì)顆粒狀，主要沉積在海馬CA1區(qū)和CA3錐體細(xì)胞層及齒狀回的顆粒細(xì)胞層。對照組大鼠海馬結(jié)構(gòu)可見少量的Caspase-3陽性神經(jīng)元；模型組陽性反應(yīng)產(chǎn)物著色

14、較對照組加深，平均光密度值較對照組顯著增高(P＜0.01)；而GSRb1中、大劑量組Caspase-3陽性反應(yīng)產(chǎn)物的平均光密度值較模型組明顯減少(P＜0.05)。
　　 2、體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 (1)MTT結(jié)果顯示：給藥24h后Aβ模型組細(xì)胞生存率(48.55±1.39％)明顯低于PC12對照組(99.23±1.35％)(P＜0.05)，而這種降低可被GSRb1小、中、大劑量(64.45±1.67％、72.34±1.34

15、％、81.67±1.09％)所抑制(P＜0.05)，且呈劑量依賴性。
　　 (2)流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示：給藥24h后Aβ模型組細(xì)胞凋亡百分率(54.09±2.85)％明顯高于PC12對照組(0.29士0.01％)(P＜0.05)，而這種升高可被GSRb1小、中、大劑量(46.17±2.94％、32.34±2.68％、20.50±1.23％)所抑制(P＜0.05)，且呈劑量依賴性。
　　 (3)ROS相對熒光強(qiáng)度檢測結(jié)果顯示

16、：給藥24h后Aβ模型組細(xì)胞內(nèi)ROS的相對熒光強(qiáng)度(370±24.58)明顯高于PC12細(xì)胞對照組(80±5.49)(P＜0.05)，而這種升高可被GSRb1小、中、大劑量(330±21.78、310.34±32.81、150.50±17.45)所抑制(P＜0.05)，且呈劑量依賴性。
　　 (4)Western blotting結(jié)果顯示：給藥24h后Aβ模型組細(xì)胞內(nèi)p-ERK、p-P38蛋白表達(dá)明顯高于PC12細(xì)胞對照組(P＜

17、0.05)，而這種升高可被GSRb1小、中、大劑量所抑制(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、人參皂甙Rb1可通過提高Aβ模型大鼠海馬結(jié)構(gòu)SOD和GSH-PX酶活性、降低MDA含量，增強(qiáng)海馬結(jié)構(gòu)神經(jīng)元的抗氧化能力，從而提高動物的認(rèn)知能力。
　　 2、人參皂甙Rb1可通過上調(diào)海馬結(jié)構(gòu)抗凋亡蛋白Bcl-2、下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)、改變Bax/Bcl-2的平衡比值，降低凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的表達(dá)等環(huán)