黃芪總苷對糖皮質(zhì)激素和β-淀粉樣蛋白協(xié)同誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的保護作用及其機制研究.pdf

1、背景：
　　 阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種常見于老年人的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。臨床上表現(xiàn)為隱襲起病、不可逆進行性發(fā)展的記憶減退，認(rèn)知功能下降，行為異常和社交障礙等，給家庭和社會帶來巨大的負(fù)擔(dān)。隨著我國進入老齡化社會，AD患者將會越來越多。因此，研究AD的發(fā)生發(fā)展機制，尋找防治AD的藥物具有重要的意義。
　　 阿爾茨海默病的特征性病變是老年斑，Aβ是老年斑的特征性成分，也是形成的主要物質(zhì)

2、基礎(chǔ)。Aβ具有細(xì)胞毒性作用，能增強或放大各種傷害性刺激對神經(jīng)細(xì)胞的損傷。研究發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激和外源性糖皮質(zhì)激素暴露均可導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠腦組織Aβ生成增加，促進Aβ沉積和老年斑的形成。因此研究糖皮質(zhì)激素和Aβ協(xié)同作用對神經(jīng)元的損傷及其在AD發(fā)生和發(fā)展中的作用具有重要意義。
　　 黃芪是傳統(tǒng)抗衰老中藥，具有補中益氣、扶正固本和促智等功效。黃芪總苷(Astragalosides，AST)是從黃芪中提取的有效部位，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、

3、促智、抗衰老和神經(jīng)保護作用。臨床常用于防治心腦血管疾病、促智、延緩衰老、免疫功能紊亂性疾病和抗腫瘤等多種疾病。本課題在前期研究的基礎(chǔ)上，進一步研究糖皮質(zhì)激素和Aβ對神經(jīng)元的損傷作用及在AD發(fā)病中的作用，同時研究黃芪總苷對糖皮質(zhì)激素和Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的保護作用及其機制。
　　 方法與結(jié)果：
　　 第一部分黃芪總苷對糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷的保護作用及其機制
　　 本實驗采用地塞米松（DEX，5mg/kg，i

4、g 21d）誘導(dǎo)12月齡小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙和神經(jīng)元損傷，用自主活動儀測定造模后第10天和第20天小鼠的自主活動；采用Morris水迷宮觀察小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能；采用HE染色觀察小鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)變化；采用Hoechst 33258染色熒光顯微鏡觀察腦組織皮層和海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡；采用RT-PCR檢測小鼠腦組織中β淀粉樣前體蛋白（APP）、α-分泌酶、β-分泌酶，Caspase-3 mRNA的表達(dá)水平；采用免疫組化檢測小鼠腦組織

5、APP、細(xì)胞色素c和Caspase-3的表達(dá)水平；采用Ac-DEVD-pNA和Ac-LEHD-pNA裂解法測定小鼠腦組織Caspase-3和Caspase-9的活性。
　　 實驗結(jié)果顯示，DEX能減少小鼠自主活動，AST40mg/kg組在造模后第10天能增加小鼠的自主活動；水迷宮結(jié)果顯示，DEX能減少小鼠在平臺象限游泳時間和穿過平臺次數(shù)，人參皂苷Rg1和AST20、40mg/kg能增加小鼠在平臺象限的游泳時間，人參皂苷Rg1和4

6、0mg/kg能增加小鼠穿過平臺的次數(shù)。HE染色和Hoechst 33258染色結(jié)果顯示，DEX能導(dǎo)致腦組織海馬CA1、CA3區(qū)和皮層神經(jīng)元損傷和凋亡，AST對神經(jīng)元的損傷和凋亡有一定的改善作用。RT-PCR分析顯示，DEX能增加APP695、APP751，β-分泌酶和Caspase-3 mRNA的表達(dá)減少α-分泌酶mRNA表達(dá)。AST (20，40 mg·kg-1)和人參皂苷Rg1可降低DEX誘導(dǎo)升高的APP695、APP751，β-分

7、泌酶和Caspase-3 mRNA水平，升高α-分泌酶mRNA水平。免疫組化結(jié)果顯示，DEX可增加小鼠腦組織皮層和海馬CA1、CA3區(qū)APP、細(xì)胞色素c和Caspase-3表達(dá)，AST和Rg1能不同程度減少APP、細(xì)胞色素c和Caspase-3表達(dá)量。DEX能升高小鼠腦組織caspase-3、caspase-9活性，AST20、40mg/kg組小鼠腦組織caspase-3、caspase-9的活性有一定的降低作用。
　　 第二部

8、分黃芪總苷對糖皮質(zhì)激素和Aβ協(xié)同誘導(dǎo)大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷的保護作用及其機制研究
　　 本實驗采用Aβ25-35雙側(cè)海馬Cal區(qū)注射同時灌胃地塞米松（DEX）14天建立大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷模型，采用Morris水迷宮檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶功能；采用HE染色觀察大鼠腦組織海馬CA1區(qū)病理形態(tài)學(xué)變化；采用Hoechst 33258染色熒光顯微鏡觀察腦組織海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡；采用電鏡觀察大鼠腦組織海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)；采用RT-PCR檢測大鼠腦組織

9、中β淀粉樣前體蛋白（APP）、α-分泌酶、β-分泌酶，Caspase-3 mRNA的表達(dá)水平；采用免疫組化檢測大鼠腦組織海馬CA1區(qū)APP、Aβ1-40、細(xì)胞色素c和Caspase-3的表達(dá)水平；采用western blot檢測大鼠海馬組織APP蛋白表達(dá)水平；采用ELISA試劑盒檢測大鼠海馬組織Aβ1-40含量。
　　 實驗結(jié)果顯示，DEX和Aβ協(xié)同作用能延長大鼠水迷宮第4天平均逃避潛伏期，減少平臺象限游泳時間和穿過平臺次數(shù)明顯

10、，人參皂苷Rg1組和AST20、40mg/kg組能增加小鼠在平臺象限的游泳時間和穿過平臺的次數(shù)。HE染色和Hoechst 33258染色結(jié)果顯示，DEX和Aβ協(xié)同作用能導(dǎo)致大鼠腦組織海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷和凋亡，AST對神經(jīng)元的損傷具有一定的保護作用。電鏡檢查結(jié)果顯示，DEX和Aβ協(xié)同作用大鼠腦組織海馬神經(jīng)元染色質(zhì)有邊集現(xiàn)象，胞漿內(nèi)有大量的空泡形成，線粒體腫脹明顯，脊消失，核糖體數(shù)量明顯減少。人參皂苷Rg1和AST20、40mg/kg對

11、大鼠腦組織海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)有一定改善作用，染色質(zhì)邊集現(xiàn)象較少，線粒體腫脹減輕，核糖體數(shù)目增加。RT-PCR分析顯示，DEX和Aβ協(xié)同作用能增加APP695、APP751，β-分泌酶和Caspase-3 mRNA的表達(dá)，減少α-分泌酶mRNA表達(dá)。AST (20，40 mg·kg-1)和人參皂苷Rg1對DEX和Aβ誘導(dǎo)升高的APP695、APP751，β-分泌酶和Caspase-3 mRNA水平有一定的降低作用，對α-分泌酶mRNA水平

12、有一定的升高作用。免疫組化結(jié)果顯示，DEX和Aβ協(xié)同作用可增加大鼠腦組織海馬CA1區(qū)APP、Aβ1-40、細(xì)胞色素c和Caspase-3表達(dá)，AST和Rg1能不同程度減少APP、Aβ1-40、細(xì)胞色素c和Caspase-3表達(dá)量。Western blot和ELISA結(jié)果顯示，DEX和Aβ協(xié)同作用可增加大鼠腦組織海馬CA1區(qū)APP、Aβ1-40表達(dá)，AST和Rg1能不同程度減少APP、Aβ1-40表達(dá)量。
　　 第三部分黃芪總苷對

13、糖皮質(zhì)激素和Aβ協(xié)同誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護作用及其機制研究
　　 本實驗在體外觀察DEX、Aβ和DEX+Aβ對PC12細(xì)胞的損傷作用和AST的保護作用及其機制。采用MTT法檢測PC12細(xì)胞活力；采用Annexin-Ⅴ/PI雙染和PI單染通過流式細(xì)胞儀檢測PC12細(xì)胞凋亡情況；采用RT-PCR檢測PC12細(xì)胞β淀粉樣前體蛋白（APP）、α-分泌酶、β-分泌酶，Caspase-3 mRNA的表達(dá)水平；采用western blot

14、 檢測PC12細(xì)胞APP蛋白表達(dá)水平。
　　 MTT結(jié)果顯示，DEX（0.1、1μmol/L）在作用24h后對PC12細(xì)胞活力沒有明顯的影響，而DEX（5、10μmol/L）在作用24h后能明顯降低PC12細(xì)胞的細(xì)胞活力（D5，P<0.05; D10，P<0.01）；Aβ（1、5、10μmol/L）在作用24h后對PC12細(xì)胞的活力均有一定的降低作用（P<0.05），DEX+Aβ各劑量組均能明顯降低PC12的細(xì)胞活力（P<0.0

15、1），人參皂苷Rg1（16μmol/L）和AST（10、20mg/L）對損傷的PC12細(xì)胞活力有一定的升高作用。流失細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，DEX+Aβ作用24h可明顯增加PC12細(xì)胞的凋亡率，人參皂苷Rg1和AST對PC12細(xì)胞的凋亡率有不同程度的降低作用。RT-PCR和western blot分析顯示，DEX+Aβ能明顯增加APP770，β-分泌酶和Caspase-3 mRNA的水平，降低α-分泌酶mRNA水平，增加APP蛋白表達(dá)。人參

16、皂苷Rg1和AST（10、20mg/L）對升高的APP770，β-分泌酶和Caspase-3 mRNA水平有一定的降低作用，對α-分泌酶mRNA水平有一定的升高作用，能降低APP蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 應(yīng)激水平的糖皮質(zhì)激素能降低小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，對小鼠腦組織皮層和海馬神經(jīng)元具有一定的損傷作用；糖皮質(zhì)激素和Aβ協(xié)同作用能促進大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙，促進對大鼠海馬神經(jīng)元和PC12細(xì)胞的損傷作用。其機制可能與增加AP

17、P的表達(dá)，影響與APP代謝相關(guān)酶的表達(dá)，導(dǎo)致Aβ的生成增多以及促進線粒體損傷、細(xì)胞色素c釋放、Caspase-9和Caspase-3表達(dá)誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡有關(guān)。表明糖皮質(zhì)激素和Aβ協(xié)同作用在AD的發(fā)病和發(fā)展中可能起著重要的作用。
　　 黃芪總苷對糖皮質(zhì)激素、糖皮質(zhì)激素協(xié)同Aβ誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶功能障礙、神經(jīng)元和PC12細(xì)胞損傷具有一定的改善作用，其作用機制可能與抑制APP表達(dá)，減少Aβ生成，降低糖皮質(zhì)激素和Aβ神經(jīng)毒性作用，抑制神經(jīng)元的