新型肥大細(xì)胞傳感器的構(gòu)建及用于肉毒毒素的檢測(cè)研究.pdf

1、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全檢測(cè)、傳染病診斷、生物恐怖現(xiàn)場(chǎng)處置等都迫切需要快速、準(zhǔn)確檢測(cè)病原體和生物毒素的方法。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要有形態(tài)學(xué)方法，生物化學(xué)方法，免疫學(xué)方法和核酸檢測(cè)方法。然而這些方法一般費(fèi)時(shí)費(fèi)力，或者靈敏度不高，其應(yīng)用都存在一定的局限。核酸檢測(cè)方法具有較高的靈敏度，但其需要較純凈的樣品并且不能檢測(cè)蛋白質(zhì)?；诎l(fā)光檢測(cè)的細(xì)胞傳感器是近幾年來發(fā)展起來的新型檢測(cè)技術(shù)，這種傳感器利用生物或化學(xué)發(fā)光原理，具有靈敏度高，特異性好，檢測(cè)速度快等優(yōu)

2、點(diǎn)，是一項(xiàng)具有巨大潛在價(jià)值的技術(shù)。
　　本研究目的是制備一種基于水母發(fā)光蛋白(Aequorin)的肥大細(xì)胞傳感器，并對(duì)影響檢測(cè)模型的因素進(jìn)行研究，最終建立基于細(xì)胞傳感器的檢測(cè)技術(shù)，并應(yīng)用于生物毒素的檢測(cè)。
　　首先將aequorin在大腸桿菌（E.coli）細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，以驗(yàn)證序列的有效性并初步研究aequorin的發(fā)光特性。Aequorin的編碼序列(AeqD)由NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，然后對(duì)該野生型序列進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后

3、的序列(命名為Aeq X)進(jìn)行合成并被克隆到原核表達(dá)載體pET-his上。構(gòu)建好的pET-AEQ被轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。對(duì)表達(dá)的蛋白使用Ni2+親和柱進(jìn)行親和純化。取純化后的樣品和腔腸素孵育后置于發(fā)光檢測(cè)儀上自動(dòng)加入CaCl2溶液然后進(jìn)行發(fā)光試驗(yàn)和光子計(jì)數(shù)，以測(cè)定蛋白的發(fā)光活性。隨后對(duì)aequorin的發(fā)光特性進(jìn)行了一系列的研究。研究發(fā)現(xiàn)aequorin在大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)以可溶性形式存在，并且具有較高的活

4、性。發(fā)光試驗(yàn)中，加入CaCl2以后，光信號(hào)在0.4 s內(nèi)迅速升高到最大，然后迅速衰減，形成了一個(gè)明顯的發(fā)光脈沖峰，這是我們觀察到的aequorin的典型發(fā)光特征。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)β-巰基乙醇對(duì)其發(fā)光活性具有顯著影響，反應(yīng)中加入β-巰基乙醇可以顯著提高aequorin發(fā)光的信號(hào)強(qiáng)度，并能有效降低背景信號(hào)強(qiáng)度。另外，在0.16 ng到1.6μg范圍內(nèi)的aequorin發(fā)光活性與蛋白濃度的線性關(guān)系良好，決定系數(shù)R2達(dá)0.993。
　　然后將a

5、equorin在選用的肥大細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，篩選出穩(wěn)定表達(dá)aequorin的細(xì)胞，建立肥大細(xì)胞傳感器技術(shù)。Aeq X基因被克隆到哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pEGFP-Cl上，實(shí)現(xiàn)GFP和aequorin的融合表達(dá)。將構(gòu)建好的pEGFP-AEQ表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到大鼠嗜堿性粒細(xì)胞白血病（rat basophilic leukemia，RBL）肥大細(xì)胞（RBL-2H3細(xì)胞）中，隨后對(duì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞置于800 mM G418的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選至匯合率低于10％時(shí)，

6、換用400 mM的G418的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。然后采用有限稀釋法從穩(wěn)定細(xì)胞群中篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆。使用DNP-BSA和抗DNP IgE抗體建立了肥大細(xì)胞傳感器的檢測(cè)模型，隨后對(duì)可能影響檢測(cè)的因素，包括腔腸素濃度，腔腸素孵育時(shí)間和抗體孵育時(shí)間進(jìn)行了研究。通過該部分工作實(shí)現(xiàn)了aequorin在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的高效表達(dá)，GFP-Aequorin融合蛋白的發(fā)光活性比單獨(dú)的aequorin的發(fā)光提高了約4倍。孵育了抗DNP的IgE抗體的RBL-2

7、H3細(xì)胞可以特異地識(shí)別DNP-BSA并激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)光。沒有抗原存在的情況下或者沒有孵育抗體的細(xì)胞均不能發(fā)光。說明，構(gòu)建的RBL-2H3細(xì)胞可用于特定抗原的檢測(cè)，特異性較好。細(xì)胞被激活后迅速發(fā)光然后迅速衰減，形成一個(gè)明顯的發(fā)光峰，發(fā)光過程在2 min內(nèi)完成，檢測(cè)需時(shí)較短。完整aequorin的形成需要一定濃度的腔腸素并孵育一定的時(shí)間，腔腸素的濃度和孵育時(shí)間可能影響aequorin的產(chǎn)率，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過低濃度的腔腸素

8、導(dǎo)致信號(hào)值較低，而過高濃度的腔腸素會(huì)造成背景值的升高，5μM的腔腸素濃度能獲得最佳的信噪比;太短的孵育時(shí)間不能保證aequorin的產(chǎn)率，孵育時(shí)間在1h到4h都能獲得比較好的發(fā)光性能和檢測(cè)效果。另外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抗體孵育時(shí)間為1h時(shí)可以獲得較好的發(fā)光和檢測(cè)效果，隨著抗體孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的信號(hào)值和靈敏度會(huì)迅速下降。
　　另外，為了將肥大細(xì)胞傳感器用于肉毒毒素的檢測(cè)，利用B型肉毒毒素(botulinumneurotoxin type

9、B，BoNT/B)的蛋白受體制備了一種嵌合抗體。21個(gè)氨基酸組成的序列(p21)來自BoNT/B蛋白受體突觸結(jié)合蛋白Ⅱ（synaptotagminⅡ，SytⅡ）的40-60位氨基酸序列。IgE抗體重鏈的CH3CH4結(jié)構(gòu)域的序列，由GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得。由一段連接肽序列((G4S)3)將二者結(jié)合起來，構(gòu)成單鏈嵌合抗體的序列(p21-CH3CH4)，序列3，端添加6×his標(biāo)簽，然后將該序列進(jìn)行合成，隨后被構(gòu)建入pPICZα A載體上。

10、構(gòu)建好的pPICZα-p21-CH3CH4被轉(zhuǎn)入到巴斯德畢赤酵母野生菌株X33中進(jìn)行表達(dá)。對(duì)表達(dá)的嵌合抗體p21-Fcε進(jìn)行親和層析和凝膠過濾層析，從而獲得純度較高的嵌合抗體。隨后采用免疫印跡和ELISA技術(shù)對(duì)嵌合抗體及其與BoNT/B的結(jié)合能力及特異性進(jìn)行了鑒定。研究表明嵌合抗體p21-Fcε在巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中以可溶的形式實(shí)現(xiàn)了高效的分泌表達(dá)，經(jīng)過純化獲得了純度較高的目的蛋白。經(jīng)免疫印跡分析，嵌合抗體在還原條件下以單體的形式存

11、在，而在非還原條件下，兩個(gè)單體之間由二硫鍵連接形成二價(jià)抗體。ELISA試驗(yàn)證實(shí)嵌合抗體和BoNT/B之間具有較高的親和力，但同時(shí)與A型肉毒毒素(botulinum neurotoxin type A，BoNT/A)復(fù)合物也有一定的結(jié)合。
　　最后將構(gòu)建的肥大細(xì)胞傳感器和制備的嵌合抗體結(jié)合起來進(jìn)行肉毒毒素的檢測(cè)。使用化學(xué)偶聯(lián)方法在DADPA修飾的磁珠表面偶聯(lián)BoNT/B的多克隆抗體，用于樣品的濃縮和并使單體毒素形成多聚體。將肥大細(xì)胞

12、用于BoNT/B的檢測(cè)，首先將構(gòu)建的發(fā)光肥大細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入一定濃度的嵌合IgE抗體進(jìn)行孵育，然后和5μM腔腸素進(jìn)行孵育，孵育結(jié)束將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基吸出，每孔加入30μl的BSS緩沖液;進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，取20μl的磁珠和1 mL的樣品進(jìn)行混合(PBS，pH7.2)于37℃孵育30 min，然后離心并移除部分上清，將剩余的混合物加入到準(zhǔn)備好的細(xì)胞培養(yǎng)孔中。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于發(fā)光檢測(cè)儀上，儀器每隔0.5 s自動(dòng)記錄發(fā)光數(shù)據(jù)

13、。研究表明細(xì)胞傳感器對(duì)BoNT/B具有較強(qiáng)的信號(hào)反應(yīng)，產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素（Clostridium perfringens epsilon toxin，ETX)和陰性對(duì)照沒有發(fā)光信號(hào)，然而，肥大細(xì)胞對(duì)BoNT/A也有一定的反應(yīng)。原因可能是BoNT/A樣品中含有血凝素-33對(duì)檢測(cè)造成了干擾。濃度為0.1 nM-10 nM的BoNT/B均能引發(fā)細(xì)胞的發(fā)光。肥大細(xì)胞傳感器對(duì)BoNT/B的檢測(cè)下限是0.1 nM BoNT/B。
　　通過上述

14、的工作，在大腸桿菌內(nèi)成功表達(dá)了aequorin，對(duì)aequorin的發(fā)光活性進(jìn)行了初步研究。發(fā)現(xiàn)，發(fā)光試驗(yàn)可用于aequorin的定量，檢測(cè)下限可達(dá)0.16 ng，是一種有效的定性和定量檢測(cè)的方法。然后成功將aequorin在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，并成功地應(yīng)用到了肥大細(xì)胞傳感器中，經(jīng)過優(yōu)化，對(duì)DNP-BSA的檢測(cè)下限達(dá)到了0.1ng/mL，靈敏度比文獻(xiàn)報(bào)道的提高了10倍，且檢測(cè)時(shí)間僅需2 min。另外制備的嵌合抗體p21-Fcε在巴