新型肥大細(xì)胞傳感器的構(gòu)建及用于肉毒毒素的檢測研究.pdf

1、環(huán)境監(jiān)測、食品安全檢測、傳染病診斷、生物恐怖現(xiàn)場處置等都迫切需要快速、準(zhǔn)確檢測病原體和生物毒素的方法。傳統(tǒng)的檢測方法主要有形態(tài)學(xué)方法，生物化學(xué)方法，免疫學(xué)方法和核酸檢測方法。然而這些方法一般費時費力，或者靈敏度不高，其應(yīng)用都存在一定的局限。核酸檢測方法具有較高的靈敏度，但其需要較純凈的樣品并且不能檢測蛋白質(zhì)?；诎l(fā)光檢測的細(xì)胞傳感器是近幾年來發(fā)展起來的新型檢測技術(shù)，這種傳感器利用生物或化學(xué)發(fā)光原理，具有靈敏度高，特異性好，檢測速度快等優(yōu)

2、點，是一項具有巨大潛在價值的技術(shù)。
　　本研究目的是制備一種基于水母發(fā)光蛋白(Aequorin)的肥大細(xì)胞傳感器，并對影響檢測模型的因素進(jìn)行研究，最終建立基于細(xì)胞傳感器的檢測技術(shù)，并應(yīng)用于生物毒素的檢測。
　　首先將aequorin在大腸桿菌（E.coli）細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，以驗證序列的有效性并初步研究aequorin的發(fā)光特性。Aequorin的編碼序列(AeqD)由NCBI核酸數(shù)據(jù)庫獲得，然后對該野生型序列進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后

3、的序列(命名為Aeq X)進(jìn)行合成并被克隆到原核表達(dá)載體pET-his上。構(gòu)建好的pET-AEQ被轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。對表達(dá)的蛋白使用Ni2+親和柱進(jìn)行親和純化。取純化后的樣品和腔腸素孵育后置于發(fā)光檢測儀上自動加入CaCl2溶液然后進(jìn)行發(fā)光試驗和光子計數(shù)，以測定蛋白的發(fā)光活性。隨后對aequorin的發(fā)光特性進(jìn)行了一系列的研究。研究發(fā)現(xiàn)aequorin在大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)以可溶性形式存在，并且具有較高的活

4、性。發(fā)光試驗中，加入CaCl2以后，光信號在0.4 s內(nèi)迅速升高到最大，然后迅速衰減，形成了一個明顯的發(fā)光脈沖峰，這是我們觀察到的aequorin的典型發(fā)光特征。試驗中發(fā)現(xiàn)β-巰基乙醇對其發(fā)光活性具有顯著影響，反應(yīng)中加入β-巰基乙醇可以顯著提高aequorin發(fā)光的信號強度，并能有效降低背景信號強度。另外，在0.16 ng到1.6μg范圍內(nèi)的aequorin發(fā)光活性與蛋白濃度的線性關(guān)系良好，決定系數(shù)R2達(dá)0.993。
　　然后將a

5、equorin在選用的肥大細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，篩選出穩(wěn)定表達(dá)aequorin的細(xì)胞，建立肥大細(xì)胞傳感器技術(shù)。Aeq X基因被克隆到哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體pEGFP-Cl上，實現(xiàn)GFP和aequorin的融合表達(dá)。將構(gòu)建好的pEGFP-AEQ表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到大鼠嗜堿性粒細(xì)胞白血?。╮at basophilic leukemia，RBL）肥大細(xì)胞（RBL-2H3細(xì)胞）中，隨后對轉(zhuǎn)染的細(xì)胞置于800 mM G418的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選至匯合率低于10％時，

6、換用400 mM的G418的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。然后采用有限稀釋法從穩(wěn)定細(xì)胞群中篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆。使用DNP-BSA和抗DNP IgE抗體建立了肥大細(xì)胞傳感器的檢測模型，隨后對可能影響檢測的因素，包括腔腸素濃度，腔腸素孵育時間和抗體孵育時間進(jìn)行了研究。通過該部分工作實現(xiàn)了aequorin在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的高效表達(dá)，GFP-Aequorin融合蛋白的發(fā)光活性比單獨的aequorin的發(fā)光提高了約4倍。孵育了抗DNP的IgE抗體的RBL-2

7、H3細(xì)胞可以特異地識別DNP-BSA并激活細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)光。沒有抗原存在的情況下或者沒有孵育抗體的細(xì)胞均不能發(fā)光。說明，構(gòu)建的RBL-2H3細(xì)胞可用于特定抗原的檢測，特異性較好。細(xì)胞被激活后迅速發(fā)光然后迅速衰減，形成一個明顯的發(fā)光峰，發(fā)光過程在2 min內(nèi)完成，檢測需時較短。完整aequorin的形成需要一定濃度的腔腸素并孵育一定的時間，腔腸素的濃度和孵育時間可能影響aequorin的產(chǎn)率，實驗發(fā)現(xiàn)，過低濃度的腔腸素

8、導(dǎo)致信號值較低，而過高濃度的腔腸素會造成背景值的升高，5μM的腔腸素濃度能獲得最佳的信噪比;太短的孵育時間不能保證aequorin的產(chǎn)率，孵育時間在1h到4h都能獲得比較好的發(fā)光性能和檢測效果。另外試驗發(fā)現(xiàn)，抗體孵育時間為1h時可以獲得較好的發(fā)光和檢測效果，隨著抗體孵育時間的延長，細(xì)胞的信號值和靈敏度會迅速下降。
　　另外，為了將肥大細(xì)胞傳感器用于肉毒毒素的檢測，利用B型肉毒毒素(botulinumneurotoxin type

9、B，BoNT/B)的蛋白受體制備了一種嵌合抗體。21個氨基酸組成的序列(p21)來自BoNT/B蛋白受體突觸結(jié)合蛋白Ⅱ（synaptotagminⅡ，SytⅡ）的40-60位氨基酸序列。IgE抗體重鏈的CH3CH4結(jié)構(gòu)域的序列，由GenBank數(shù)據(jù)庫獲得。由一段連接肽序列((G4S)3)將二者結(jié)合起來，構(gòu)成單鏈嵌合抗體的序列(p21-CH3CH4)，序列3，端添加6×his標(biāo)簽，然后將該序列進(jìn)行合成，隨后被構(gòu)建入pPICZα A載體上。

10、構(gòu)建好的pPICZα-p21-CH3CH4被轉(zhuǎn)入到巴斯德畢赤酵母野生菌株X33中進(jìn)行表達(dá)。對表達(dá)的嵌合抗體p21-Fcε進(jìn)行親和層析和凝膠過濾層析，從而獲得純度較高的嵌合抗體。隨后采用免疫印跡和ELISA技術(shù)對嵌合抗體及其與BoNT/B的結(jié)合能力及特異性進(jìn)行了鑒定。研究表明嵌合抗體p21-Fcε在巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中以可溶的形式實現(xiàn)了高效的分泌表達(dá)，經(jīng)過純化獲得了純度較高的目的蛋白。經(jīng)免疫印跡分析，嵌合抗體在還原條件下以單體的形式存

11、在，而在非還原條件下，兩個單體之間由二硫鍵連接形成二價抗體。ELISA試驗證實嵌合抗體和BoNT/B之間具有較高的親和力，但同時與A型肉毒毒素(botulinum neurotoxin type A，BoNT/A)復(fù)合物也有一定的結(jié)合。
　　最后將構(gòu)建的肥大細(xì)胞傳感器和制備的嵌合抗體結(jié)合起來進(jìn)行肉毒毒素的檢測。使用化學(xué)偶聯(lián)方法在DADPA修飾的磁珠表面偶聯(lián)BoNT/B的多克隆抗體，用于樣品的濃縮和并使單體毒素形成多聚體。將肥大細(xì)胞

12、用于BoNT/B的檢測，首先將構(gòu)建的發(fā)光肥大細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入一定濃度的嵌合IgE抗體進(jìn)行孵育，然后和5μM腔腸素進(jìn)行孵育，孵育結(jié)束將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基吸出，每孔加入30μl的BSS緩沖液;進(jìn)行檢測時，取20μl的磁珠和1 mL的樣品進(jìn)行混合(PBS，pH7.2)于37℃孵育30 min，然后離心并移除部分上清，將剩余的混合物加入到準(zhǔn)備好的細(xì)胞培養(yǎng)孔中。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于發(fā)光檢測儀上，儀器每隔0.5 s自動記錄發(fā)光數(shù)據(jù)

13、。研究表明細(xì)胞傳感器對BoNT/B具有較強的信號反應(yīng)，產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素（Clostridium perfringens epsilon toxin，ETX)和陰性對照沒有發(fā)光信號，然而，肥大細(xì)胞對BoNT/A也有一定的反應(yīng)。原因可能是BoNT/A樣品中含有血凝素-33對檢測造成了干擾。濃度為0.1 nM-10 nM的BoNT/B均能引發(fā)細(xì)胞的發(fā)光。肥大細(xì)胞傳感器對BoNT/B的檢測下限是0.1 nM BoNT/B。
　　通過上述

14、的工作，在大腸桿菌內(nèi)成功表達(dá)了aequorin，對aequorin的發(fā)光活性進(jìn)行了初步研究。發(fā)現(xiàn)，發(fā)光試驗可用于aequorin的定量，檢測下限可達(dá)0.16 ng，是一種有效的定性和定量檢測的方法。然后成功將aequorin在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)實現(xiàn)了表達(dá)，并成功地應(yīng)用到了肥大細(xì)胞傳感器中，經(jīng)過優(yōu)化，對DNP-BSA的檢測下限達(dá)到了0.1ng/mL，靈敏度比文獻(xiàn)報道的提高了10倍，且檢測時間僅需2 min。另外制備的嵌合抗體p21-Fcε在巴