調(diào)肝治法方藥抗心理應(yīng)激損傷的部分神經(jīng)免疫學(xué)機(jī)制研究.pdf

1、一、文獻(xiàn)綜述與理論探討: 本研究團(tuán)隊(duì)以往一系列研究亦表明：中醫(yī)肝主疏泄調(diào)暢情志的功能在實(shí)現(xiàn)對(duì)下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)的整體性調(diào)節(jié)上，還可能存在著一定的具體的中樞神經(jīng)機(jī)制；在作用機(jī)理上體現(xiàn)出局部(中樞神經(jīng)機(jī)制)與整體(NIM 網(wǎng)絡(luò))的有機(jī)統(tǒng)一。并且以加味四逆散(JWSNS)為調(diào)肝治法方藥之代表方，采用“方-證-效-臟腑功能本質(zhì)”的研究思路，對(duì)慢性應(yīng)激損傷及調(diào)肝方藥的作用機(jī)制進(jìn)行了一系列的研究，探討肝主疏泄調(diào)暢情志功能的中樞神經(jīng)

2、生物學(xué)機(jī)制，其具體機(jī)制有待一步探討。 本論文旨在進(jìn)一步研究不同性別、年齡情況下慢性心理應(yīng)激反應(yīng)損傷的HPA軸等神經(jīng)內(nèi)分泌免疫學(xué)作用機(jī)制，以及中藥復(fù)方對(duì)其的干預(yù)作用，為最終從整體上闡明心理應(yīng)激作用機(jī)制及中醫(yī)調(diào)肝治法方藥抗心理應(yīng)激損傷的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。 二、研究目標(biāo)與內(nèi)容: 研究目標(biāo)：開(kāi)展調(diào)肝方藥——加味四逆散(JWSNS)抗心理應(yīng)激損傷HPA軸作用方式及其神經(jīng)內(nèi)分泌免疫變化的實(shí)驗(yàn)研究，嘗試闡明調(diào)肝治法抗不良心理應(yīng)

3、激損傷的神經(jīng)內(nèi)分泌作用機(jī)制，探求安全有效的中醫(yī)藥抗心理應(yīng)激方法。進(jìn)而，從細(xì)胞及分子水平進(jìn)一步探討調(diào)肝方藥一加味四逆散(JWSNS)在心理應(yīng)激損傷狀態(tài)下多層次、多靶點(diǎn)調(diào)控 NIM 網(wǎng)絡(luò)的作用機(jī)制，更加深入揭示加味四逆散抗心理應(yīng)激損傷的神經(jīng)免疫學(xué)的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用方式。 研究?jī)?nèi)容：建立慢性輕度不可預(yù)計(jì)應(yīng)激損傷大鼠模型，檢測(cè)各試驗(yàn)組分中免疫功能的變化，及其神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控過(guò)程中外周與中樞各類(lèi)激素等主要生化指標(biāo)與病理改變，觀察調(diào)肝方藥JW

4、SNS的調(diào)控作用，以HPA軸為重點(diǎn)，探討其作用可能的機(jī)制與途徑，研討調(diào)暢情志疏肝之法在抗心理應(yīng)激損傷中的作用機(jī)理。 (一)慢性輕度不可預(yù)計(jì)應(yīng)激損傷大鼠模型的建立 本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟诮⒙暂p度不可預(yù)計(jì)應(yīng)激模型，觀察不同年齡、性別大鼠模型的特征。用表面效度、結(jié)構(gòu)效度和預(yù)測(cè)效度三個(gè)效度對(duì)其進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。大鼠基本狀況觀察結(jié)果表明，隨著造模工作的進(jìn)行，模型組大鼠整體狀況不斷明顯下降，焦慮，煩躁不安，排便增多，部分過(guò)程拒絕，呼吸急促，

5、毛色發(fā)黯，發(fā)黃，存在修飾行為，但不斷減少，直到基本消失。治療組整體狀態(tài)強(qiáng)于模型組，但略弱于正常組，表現(xiàn)為較安靜，毛色雖雜亂，但略有光澤，修飾行為減少，抵抗行為減少，表明經(jīng)中藥復(fù)方JWSNS組干預(yù)，基本狀況有好轉(zhuǎn)，但在應(yīng)激源未解除之前，仍較疲倦。糖水消耗偏愛(ài)度是判斷大鼠抑郁應(yīng)激程度的重要指標(biāo)。數(shù)據(jù)表明，模型大鼠糖水消耗偏愛(ài)度減少，提示模型成功，而中藥復(fù)方JWSNS干預(yù)，糖水消耗偏愛(ài)度顯著提高，與正常組無(wú)顯著差異，提示中藥復(fù)方JWSNS可能

6、干預(yù)慢性心理應(yīng)激損傷，此結(jié)果與以往一致。其中，幼年鼠正常組因處于生長(zhǎng)期，糖水消耗偏愛(ài)度隨體重呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，但模型組三周后糖水消耗偏愛(ài)度顯著減少 (p<0.01)，表明慢性應(yīng)激對(duì)其產(chǎn)生較為嚴(yán)重的損傷，導(dǎo)致其不升反降；成年鼠正常組糖水消耗偏愛(ài)度未顯示隨體重而增長(zhǎng)趨勢(shì)，模型組三周后糖水消耗顯著減少(p<0.01)，經(jīng)中藥治療有顯著改善(p<0.01)，表現(xiàn)出一定的穩(wěn)定性。體重方面，各組正常大鼠體重增長(zhǎng)平穩(wěn)，雄性組略快，而經(jīng)造模后體重增長(zhǎng)顯著變緩

7、(p<0.01)，提示長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)激導(dǎo)致機(jī)體的綜合狀況顯著下降，經(jīng)治療后有改善，但與正常組相比仍有顯著差異(19<0.01)，無(wú)法復(fù)原，表明中藥復(fù)方可以有效緩解其應(yīng)激狀態(tài)，但無(wú)法改變其只要應(yīng)激源持續(xù)存在就必然所造成的損傷與壓力。 性別是影響應(yīng)激作用的重要因素。結(jié)果表明，就心理應(yīng)激而言，雌性和雄性動(dòng)物之間存在顯著的性別差異，兩種動(dòng)物在行為表現(xiàn)、內(nèi)分泌和病理生理等多個(gè)方面也存在顯著差別。雌雄間比較，雄性對(duì)糖水消耗偏愛(ài)度更為穩(wěn)定一些，總體

8、趨勢(shì)呈下降；雌性大鼠則在第一周即出現(xiàn)顯著下降，隨后又有所恢復(fù)，進(jìn)而第三周又顯著下降，提示雌性可能對(duì)急性應(yīng)激更為強(qiáng)烈，進(jìn)而轉(zhuǎn)為慢性應(yīng)激狀態(tài)。 (二)加味四逆散對(duì)慢性心理應(yīng)激大鼠下丘腦-垂體-靶腺軸的調(diào)節(jié) 本實(shí)驗(yàn)旨在觀察慢性心理應(yīng)激狀態(tài)下大鼠腎上腺、甲狀腺、性腺軸的外周分泌激素的改變及其主要作用途徑。本研究結(jié)果顯示，成年組雄激素有顯著改變，雌性激素有改變趨勢(shì)，而T3、T4 含量無(wú)明顯改變。表現(xiàn)為，雄性造模組雄激素顯著升高 (

9、p<0.01)，經(jīng)JWSNS治療后下降與正常組無(wú)顯著差異，提示心理應(yīng)激對(duì)成年雄性大鼠HPG外周功能造成了影響，經(jīng)中藥干預(yù)后顯著下降，很好地起到調(diào)控應(yīng)激損傷的作用；HPA軸是慢性心理應(yīng)激反應(yīng)的主要途徑。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，慢性應(yīng)激作用下HPA軸發(fā)生了顯著變化，而雌雄間顯示一定的差異。從HPA 軸整體分泌上來(lái)看，本實(shí)驗(yàn)充分顯示出 CRH、ACTH、CORT三者間的相互作用確實(shí)存在，同時(shí)也可解釋本實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，雌雄組間不同的變化趨勢(shì)及多組數(shù)據(jù)僅有趨勢(shì)

10、而無(wú)顯著差異的結(jié)果。例如，本實(shí)驗(yàn)總的趨勢(shì)是 HPA 軸的激活與亢進(jìn)狀態(tài)，但雌性組卻 CORT 僅顯示出趨勢(shì)，其機(jī)制有待進(jìn)一步闡明，但結(jié).ACTH 的顯著下降，是否可以看出ACTH對(duì)其的調(diào)控作用，即正是由于模型組ACTH的減少，從而使CORT的升高變緩。雄性組方面，ACTH 的變化僅有升高趨勢(shì)，其同樣存在CORT顯著升高后，對(duì)其的反饋性調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致其增高的顯著性變化減弱。而下丘腦CRH顯著高于對(duì)照組，可能是對(duì)下丘腦對(duì)血漿 ACTH、CO

11、RT 改變的反饋性調(diào)控的結(jié)果。 本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組腎上腺皮質(zhì)其形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，提示慢性心理應(yīng)激大鼠腎上腺內(nèi)分泌功能處于亢奮狀態(tài)，表現(xiàn)為皮質(zhì)增生明顯，細(xì)胞密度增高等，而中藥治療組明顯好轉(zhuǎn)，表明中藥復(fù)方對(duì)腎上腺內(nèi)分泌激素的分泌有很好的調(diào)控作用，可抑制其皮質(zhì)增生，進(jìn)而減緩糖皮質(zhì)激素的分泌。結(jié)合其免疫功能顯著抑制與降低，表明二者間的一定的因果關(guān)系。 (三)加味四逆散對(duì)慢性心理應(yīng)激大鼠免疫功能的調(diào)節(jié) 本

12、實(shí)驗(yàn)旨在觀察慢性應(yīng)激狀態(tài)下大鼠免疫功能的變化，探討其與神經(jīng)內(nèi)分泌改變的關(guān)系，嘗試明確其HPA軸主要作用途徑。結(jié)果表明，模型各組大鼠胸腺指數(shù)顯著降低，經(jīng)中藥復(fù)方干預(yù)后，胸腺指數(shù)顯著回升，表明中醫(yī)復(fù)方JWSNS可以有效提高應(yīng)激反應(yīng)后的免疫功能改變。模型各組胸腺形態(tài)學(xué)發(fā)生嚴(yán)重改變，反映出慢性應(yīng)激反應(yīng)后大鼠免疫抑制顯著，經(jīng)中醫(yī)復(fù)方JWSNS治療后器官形態(tài)有顯著改善，提示可以有效提高應(yīng)激反應(yīng)后的免疫功能改變。T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)內(nèi)功能最重要的

13、免疫細(xì)胞，對(duì)人體免疫功能有重要的調(diào)節(jié)作用，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雌性大鼠模型組CD3+、CD4+、CD8+均呈下降，CD3+下降有顯著差異(p<0.05)，經(jīng)中藥復(fù)方治療后T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+顯著回升，CD8+呈上升趨勢(shì)，并高于正常組，也顯示出雌性對(duì)應(yīng)激干預(yù)手段與藥物的敏感性；而雄性組方面，模型組T淋巴細(xì)胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+)均有所下降，經(jīng)中藥復(fù)方JWSNS治療后，有所回升，但均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型各組CD4+

14、與CD8+比值呈下降趨勢(shì)，中藥復(fù)方各組有所提高，但未有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與實(shí)驗(yàn)大鼠例數(shù)相對(duì)較少有關(guān)，尚需進(jìn)一步觀察與探討。雌雄間比較顯示，雄性應(yīng)激免疫抑制趨勢(shì)更加明顯一些，與以往報(bào)道一致。 (四)加味四逆散對(duì)慢性心理應(yīng)激大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用觀察 慢性應(yīng)激狀態(tài)下大鼠中樞海馬神經(jīng)元的變化，探討其對(duì)外周神經(jīng)內(nèi)分泌改變的調(diào)控，嘗試明確其對(duì)HPA軸主要作用途徑。海馬不僅是應(yīng)激反應(yīng)的高級(jí)調(diào)節(jié)中樞也是應(yīng)激損傷的敏感區(qū)。本次研究結(jié)果表

15、明，與正常組相比，雌雄模型組細(xì)胞凋亡率均明顯增加，海馬光密度值顯著低于正常組，海馬組織損傷明顯高于正常組；與模型組相比，雌雄JWSNS組海馬神經(jīng)元凋亡率明顯下降，JWSNS能明顯升高應(yīng)激大鼠海馬光密度值，減輕組織損傷，提示不可預(yù)計(jì)應(yīng)激模型大鼠已引起海馬神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)生變化，出現(xiàn)海馬損傷及神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。而經(jīng)加味四逆散治療干預(yù)后，海馬組織損傷明顯降低，表明其可能很好的緩解海馬損傷與神經(jīng)元細(xì)胞的調(diào)亡，具有較好的海馬神經(jīng)元保護(hù)作用。

16、 三、研究結(jié)論: 1．本實(shí)驗(yàn)對(duì)慢性不可預(yù)計(jì)心理應(yīng)激大鼠模型和復(fù)制與改制較為成功，從表面效度、結(jié)構(gòu)效度和預(yù)測(cè)效度三個(gè)效度對(duì)其進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，表明該模型大鼠行為學(xué)表現(xiàn)與人類(lèi)相應(yīng)的情緒表現(xiàn)具有一定的相似性；其反映出一定的情緒障礙的行為學(xué)和生理學(xué)的基本特征，以及共同的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制——HPA軸的調(diào)控等。而中藥復(fù)方JWSNS可有效調(diào)控慢性心理應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體的NIM網(wǎng)絡(luò)改變。 2．慢性心理應(yīng)激反應(yīng)的神經(jīng)內(nèi)分泌通路主要是HPA系統(tǒng)，此系

17、統(tǒng)的激活是應(yīng)激性外周軀體反應(yīng)、免疫功能紊亂等的生理學(xué)基礎(chǔ)，而中藥復(fù)方JWSNS可有效調(diào)控HPA軸，提示其抗應(yīng)激損傷作用機(jī)制與HPA軸密切相關(guān)。 3．慢性心理應(yīng)激反應(yīng)在不同性別中存在一定差異。心理應(yīng)激可影響到下丘腦—垂體—性腺(HPG)軸的功能，JWSNS顯示出對(duì)HPG一定的調(diào)控作用，但由于不同性別性腺激素分泌的復(fù)雜性，JWSNS作用機(jī)制與方式有待進(jìn)一研究。 4．研究結(jié)果表明，慢性應(yīng)激反應(yīng)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率顯著升高，提示