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文檔簡介
1、目的:
本研究以不同病理級別的膠質瘤組織和U87、U251腦膠質瘤細胞為實驗對象,檢測miR-98與IKKε在腦膠質瘤組織及細胞中的表達及其相關性,進一步探討miR-98介導IKKε/NF-κB通路的調控機制及與腦膠質瘤侵襲性生物學行為的關系,以期為膠質瘤的防治提供新的思路。
方法:
1.第一步通過Real-Time PCR、Western blot方法檢測53例腦膠質瘤標本、10例正常腦組織標本及膠質瘤細
2、胞中的miR-98與IKKε、NF-κB p65的表達水平,初步探究分析miR-98與IKKε、NF-κB在腦膠質瘤組織中表達的相關性。
2.第二步采用熒光素酶實驗:檢測miR-98與IKKε之間的調控關系。
3.第三步研究人腦膠質瘤細胞轉染miR-98 mimics后對膠質瘤細胞侵襲的影響及IKKε/NF-κB表達的體外研究,并初步探討其潛在機制。
a.采用miR-98 mimics轉染U87及U251膠
3、質瘤細胞,采用Real time PCR檢測miR-98及IKKε、MMP-9 mRNA的表達,采用Western blot檢測IKKε、細胞總NF-κB p65及細胞核中NF-κB p65、MMP-9蛋白表達;
b.Transwell實驗檢測轉染miR-98 mimics后侵襲能力的改變,劃痕實驗評價轉染miR-98 mimics后細胞遷移能力的改變。
4.第四步研究在腦膠質瘤中IKKε及NF-κB p65在miR
4、-98調控中的作用的體外研究,并進一步驗證其機制
a. pcDNA3/IKKε及miR-98 mimics共轉染U87及U251膠質瘤細胞,Western blot檢測IKKε、MMP-9、細胞核中NF-κB p65蛋白的表達情況。采用Real time PCR檢測IKKε、MMP-9 mRNA的表達;
b.Transwell實驗檢測轉染后細胞侵襲能力的改變,細胞劃痕實驗檢測轉染后細胞遷移能力的改變。
c.
5、 pcDNA3/NF-κB p65及miR-98 mimics共轉染U87及U251膠質瘤細胞, Western blot檢測細胞核中NF-κB p65蛋白的表達情況;Transwell實驗檢測轉染后細胞侵襲能力的改變,細胞劃痕實驗檢測轉染后細胞遷移能力的改變。
結果:
1、腦膠質瘤中miR-98、IKKε、NF-κB p65的表達相關性
a. miR-98表達水平與腦膠質瘤組織病理級別呈負相關;IKKε、
6、NF-κB P65表達水平與腦膠質瘤組織病理級別呈正相關。
b. miR-98與IKKε表達水平呈密切負相關(r2=0.7223,p<0.05),miR-98與NF-κB P65表達水平呈密切負相關(r2=0.6337,p<0.05);NF-κB P65與IKKε表達水平呈密切正相關(r2=0.6123,p<0.05)
2、U251、U87細胞較HEB細胞miR-98表達下降,IKKε表達增高;熒光素酶實驗顯示:轉染
7、miR-98 mimics后,IKKε-WT報告載體的熒光強度受到顯著抑制;而IKKε-MUT報告載體的熒光強度基本不變,說明IKKεmRNA的3’UTR上存在miR-98的結合位點,證實IKKε是miR-98下游靶基因。
3、轉染miR-98 mimics發(fā)現:a.上調miR-98能夠有效抑制腦膠質瘤侵襲與遷移能力。b.上調miR-98表達能夠下調IKKε的表達水平及抑制NF-κB p65從細胞質到細胞核的轉座,從而調控NF
8、-κB通路及抑制MMP-9的表達水平,而不影響NF-κB p65在細胞中的總含量。
4、轉染pcDNA3/IKKε及miR-98 mimics發(fā)現:a.上調IKKε能夠恢復因轉染miR-98 mimics而降低的腦膠質瘤侵襲與遷移能力;b.上調IKKε能恢復NF-κB p65的轉座從而調控NF-κB通路及恢復MMP-9的表達水平。
5、轉染IKKεsiRNA+miR-98 mimics與IKKεsiRNA+miR-9
9、8 inhibitor發(fā)現:抑制 IKKε表達后 miR-98 mimics及 miR-98 inhibitor對 NF-κB p65的轉座及MMP-9的表達無差別。
6、轉染pcDNA3/NF-κB p65及miR-98 mimics發(fā)現:上調NF-κB p65能夠恢復因轉染miR-98 mimics而降低的腦膠質瘤侵襲與遷移能力
結論:
miR-98可以通過IKKε基因調控NF-κB通路,影響腦膠質瘤細
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