香加皮提取物抗食管癌及免疫調(diào)節(jié)作用的實驗研究.pdf

1、目的：本研究從細胞分子水平研究中藥香加皮兩種提取物的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用以及它們的作用機制，以其為治療食管癌尋找有效藥物，同時為中藥香加皮的二次開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。 方法：1.采用MTT法分析不同濃度香加皮杠柳苷(CPP)作用不同時間后，對四種惡性程度不同的食管癌細胞株TE-13、Eca-109、TE-1、TE-10增殖反應(yīng)的影響。 2.用不同濃度CPP分別處理TE-13細胞48h后，采用Gimsa染色技術(shù)和流式細胞技

2、術(shù)檢測細胞凋亡和細胞周期分布情況。 3.采用Westem blot技術(shù)分析細胞周期蛋白依賴性激酶CDK2和CDK4的表達變化，以探討CPP誘導(dǎo)細胞凋亡及細胞生長周期阻滯的可能機制。 4.采用RT-PCR法分析四種食管癌細胞株TE-13、Eca-109、TE-1和TE-10 syk mRNA的表達狀態(tài)，以及經(jīng)CPP處理后syk mRNA表達的改變，同時采用流式細胞技術(shù)分析CPP處理細胞后細胞syk蛋白表達的變化。

3、5.無菌分離健康人外周血淋巴細胞，MTT法分析不同濃度香加皮羽扇豆烷乙酸酯(CPLA)對人外周血淋巴細胞增殖和對巨噬細胞吞噬功能的影響。 6.用ELISA和RT-PCR法分析CPLA對人外周血淋巴細胞產(chǎn)生細胞因子功能的影響。 結(jié)果：1.香加皮提取物杠柳苷(CPP)體外對惡性程度不同的食管癌細胞TE-13、Eca-109、TE-1、TE-10的增殖反應(yīng)均有顯著抑制作用(P＜0.01)，并呈時間和濃度依賴性，藥物濃度越大，作

4、用時間越長，抑制效應(yīng)越強。10μg/ml的CPP處理72h時，對食管癌細胞TE-13、Eca-109、TE-1的抑瘤率分別達到(84.03±0.97)％、(80.56±0.65)和(72.49±2.1)％，而對TE-10的增殖抑制作用較對。TE-13、Eca-109、TE-1細胞的抑制作用為低，72h的抑制率為(32.06±1.56)％。 2.CPP作用于腫瘤細胞后，可誘導(dǎo)典型的細胞凋亡形態(tài)變化，如細胞胞體縮小、胞質(zhì)濃縮、胞核向

5、外呈銳角突起、染色質(zhì)高度濃縮、核仁邊集于核膜下或呈新月形，有的細胞出現(xiàn)核固縮、核碎裂以及凋亡小體等典型細胞凋亡的形態(tài)特征。流式細胞分析結(jié)果也顯示，CPP能使TE-13細胞發(fā)生凋亡和生長周期阻滯，處理48h時，凋亡率明顯增加，且呈濃度依賴性；G0/G1期細胞明顯增加，S期細胞明顯減少，與對照組相比，差異有顯著性(P＜0.01)。 3.CPP能夠使TE-13細胞CDK4蛋白表達水平明顯下調(diào)，1-5μg/mlCPP均可明顯下調(diào)減少TE

6、-13細胞CDK4的表達，與對照組相比，差異有顯著性(P＜0.01)℃PP對CDK2的蛋白表達沒有明顯影響。 4.RT-PCR法分析結(jié)果顯示高度惡性的細胞株TE-13、Eca-109 sykmRNA(514bp)表達弱陽性，惡性程度比較低的食管癌細胞株TE-1syk mRNA表達水平明顯高于TE-13、Eca-09細胞，而在惡性程度比較低的食管癌細胞株TE-10中卻未檢測到syk mRNA的表達。經(jīng)CPP處理后，TE-13、Ec

7、a-109、TE-1 syk mRNA表達增強(P＜0.01)；CPP對TE-10細胞sykmRNA表達沒有影響(P＞0.05)。流式細胞技術(shù)顯示上述細胞syk蛋白表達水平結(jié)果與mRNA表達情況相符合。 5.香加皮提取物羽扇豆烷乙酸酯(CPLA)能明顯促進PHA活化的人外周血淋巴細胞的增殖以及吞噬細胞的吞噬作用，經(jīng)20μg/ml的CPLA處理72小時后，淋巴細胞的增殖指數(shù)達到1.26，與對照組相比，明顯增高(P＜0.01)；5-40μg

8、/ml的CPLA均能明顯增強吞噬細胞對腫瘤細胞的殺傷率，40μg/ml的CPLA處理吞噬細胞后，能使其對食管癌細胞TE-13的殺傷率達到54.00％。 6.ELISA檢測結(jié)果顯示，經(jīng)CPLA作用后，人外周血淋巴細胞產(chǎn)生TNF-α和IL-2水平顯著升高(P＜0.01)，且具有明顯的量效關(guān)系。RT-PCR分析結(jié)果顯示，20μg/ml和40μg/mlCPLA處理后，能明顯增強PHA的活化作用，使淋巴細胞IFN-γmRNA的表達水平明顯

9、增強(，P＜0.01)。 結(jié)論：1.香加皮提取物杠柳苷(CPP)體外能明顯抑制食管癌細胞的增殖。 2.CPP對食管癌細胞TE-13的抑制作用可能與其誘導(dǎo)細胞凋亡和細胞周期阻滯有關(guān)，CPP能使TE-13細胞的生長周期阻滯在G0/G1期，其機制可能與CPP下調(diào)細胞周期蛋白依賴性激酶CDK4的表達有關(guān)。 3.CPP的抑瘤作用可能還與其恢復(fù)候選抑癌基因sykmRNA和蛋白的表達有關(guān)，表明CPP發(fā)揮抑瘤作用是多基因、多靶點