香加皮提取物抗食管癌及免疫調(diào)節(jié)作用的實驗研究.pdf

1、目的：本研究從細(xì)胞分子水平研究中藥香加皮兩種提取物的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用以及它們的作用機(jī)制，以其為治療食管癌尋找有效藥物，同時為中藥香加皮的二次開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。 方法：1.采用MTT法分析不同濃度香加皮杠柳苷(CPP)作用不同時間后，對四種惡性程度不同的食管癌細(xì)胞株TE-13、Eca-109、TE-1、TE-10增殖反應(yīng)的影響。 2.用不同濃度CPP分別處理TE-13細(xì)胞48h后，采用Gimsa染色技術(shù)和流式細(xì)胞技

2、術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布情況。 3.采用Westem blot技術(shù)分析細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK2和CDK4的表達(dá)變化，以探討CPP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞生長周期阻滯的可能機(jī)制。 4.采用RT-PCR法分析四種食管癌細(xì)胞株TE-13、Eca-109、TE-1和TE-10 syk mRNA的表達(dá)狀態(tài)，以及經(jīng)CPP處理后syk mRNA表達(dá)的改變，同時采用流式細(xì)胞技術(shù)分析CPP處理細(xì)胞后細(xì)胞syk蛋白表達(dá)的變化。

3、5.無菌分離健康人外周血淋巴細(xì)胞，MTT法分析不同濃度香加皮羽扇豆烷乙酸酯(CPLA)對人外周血淋巴細(xì)胞增殖和對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。 6.用ELISA和RT-PCR法分析CPLA對人外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子功能的影響。 結(jié)果：1.香加皮提取物杠柳苷(CPP)體外對惡性程度不同的食管癌細(xì)胞TE-13、Eca-109、TE-1、TE-10的增殖反應(yīng)均有顯著抑制作用(P＜0.01)，并呈時間和濃度依賴性，藥物濃度越大，作

4、用時間越長，抑制效應(yīng)越強(qiáng)。10μg/ml的CPP處理72h時，對食管癌細(xì)胞TE-13、Eca-109、TE-1的抑瘤率分別達(dá)到(84.03±0.97)％、(80.56±0.65)和(72.49±2.1)％，而對TE-10的增殖抑制作用較對。TE-13、Eca-109、TE-1細(xì)胞的抑制作用為低，72h的抑制率為(32.06±1.56)％。 2.CPP作用于腫瘤細(xì)胞后，可誘導(dǎo)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)變化，如細(xì)胞胞體縮小、胞質(zhì)濃縮、胞核向

5、外呈銳角突起、染色質(zhì)高度濃縮、核仁邊集于核膜下或呈新月形，有的細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、核碎裂以及凋亡小體等典型細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征。流式細(xì)胞分析結(jié)果也顯示，CPP能使TE-13細(xì)胞發(fā)生凋亡和生長周期阻滯，處理48h時，凋亡率明顯增加，且呈濃度依賴性；G0/G1期細(xì)胞明顯增加，S期細(xì)胞明顯減少，與對照組相比，差異有顯著性(P＜0.01)。 3.CPP能夠使TE-13細(xì)胞CDK4蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，1-5μg/mlCPP均可明顯下調(diào)減少TE

6、-13細(xì)胞CDK4的表達(dá)，與對照組相比，差異有顯著性(P＜0.01)℃PP對CDK2的蛋白表達(dá)沒有明顯影響。 4.RT-PCR法分析結(jié)果顯示高度惡性的細(xì)胞株TE-13、Eca-109 sykmRNA(514bp)表達(dá)弱陽性，惡性程度比較低的食管癌細(xì)胞株TE-1syk mRNA表達(dá)水平明顯高于TE-13、Eca-09細(xì)胞，而在惡性程度比較低的食管癌細(xì)胞株TE-10中卻未檢測到syk mRNA的表達(dá)。經(jīng)CPP處理后，TE-13、Ec

7、a-109、TE-1 syk mRNA表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.01)；CPP對TE-10細(xì)胞sykmRNA表達(dá)沒有影響(P＞0.05)。流式細(xì)胞技術(shù)顯示上述細(xì)胞syk蛋白表達(dá)水平結(jié)果與mRNA表達(dá)情況相符合。 5.香加皮提取物羽扇豆烷乙酸酯(CPLA)能明顯促進(jìn)PHA活化的人外周血淋巴細(xì)胞的增殖以及吞噬細(xì)胞的吞噬作用，經(jīng)20μg/ml的CPLA處理72小時后，淋巴細(xì)胞的增殖指數(shù)達(dá)到1.26，與對照組相比，明顯增高(P＜0.01)；5-40μg

8、/ml的CPLA均能明顯增強(qiáng)吞噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷率，40μg/ml的CPLA處理吞噬細(xì)胞后，能使其對食管癌細(xì)胞TE-13的殺傷率達(dá)到54.00％。 6.ELISA檢測結(jié)果顯示，經(jīng)CPLA作用后，人外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和IL-2水平顯著升高(P＜0.01)，且具有明顯的量效關(guān)系。RT-PCR分析結(jié)果顯示，20μg/ml和40μg/mlCPLA處理后，能明顯增強(qiáng)PHA的活化作用，使淋巴細(xì)胞IFN-γmRNA的表達(dá)水平明顯

9、增強(qiáng)(，P＜0.01)。 結(jié)論：1.香加皮提取物杠柳苷(CPP)體外能明顯抑制食管癌細(xì)胞的增殖。 2.CPP對食管癌細(xì)胞TE-13的抑制作用可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯有關(guān)，CPP能使TE-13細(xì)胞的生長周期阻滯在G0/G1期，其機(jī)制可能與CPP下調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK4的表達(dá)有關(guān)。 3.CPP的抑瘤作用可能還與其恢復(fù)候選抑癌基因sykmRNA和蛋白的表達(dá)有關(guān)，表明CPP發(fā)揮抑瘤作用是多基因、多靶點