腦震蕩打擊酒精性腦病大鼠的死亡機(jī)制研究.pdf

1、1背景及目的：
　　酗酒嚴(yán)重危害人身健康。在慢性酒精中毒的全身性毒理學(xué)作用中，腦損害表現(xiàn)最明顯，亦最受人們關(guān)注。其常表現(xiàn)為性格改變，精神萎靡，認(rèn)知障礙，記憶能力下降，甚至出現(xiàn)幻覺、妄想、躁動(dòng)、抑郁、昏睡或昏迷等癥狀，嚴(yán)重者危及生命，稱之為酒精性腦病。在臨床及法醫(yī)實(shí)踐中，常遇到慢性酗酒者遭受輕微頭部外傷后，出現(xiàn)嚴(yán)重臨床癥狀，甚至死亡，然而其具體機(jī)制尚不明了，造成臨床診治及法醫(yī)鑒定的困惑。
　　酒精性腦病者常規(guī)影像學(xué)檢測(cè)顯示大腦

2、皮質(zhì)和白質(zhì)萎縮，腦室腦池?cái)U(kuò)大，腦溝增寬，胼胝體及腦橋變性等；病理檢查呈大腦及小腦萎縮，腦體積及質(zhì)量減小。然而，這些臨床-病理改變往往出現(xiàn)于慢性酒精中毒的晚期，甚至病人死后病理檢查才發(fā)現(xiàn)。而酒精性腦病早期臨床診斷，及其相關(guān)治療干預(yù)一直是人們研究的方向。
　　本課題組前期研究證實(shí)，慢性酒精中毒大鼠遭受輕微的腦震蕩性打擊后，死亡率明顯高于慢性灌水-打擊組和急性酒精中毒-打擊組，并發(fā)現(xiàn)了酗酒引起腦血管退變、抑制腦紅蛋白(Ngb)相關(guān)氧和能

3、量代謝、鈉鉀泵功能障礙以及腦干神經(jīng)元暗細(xì)胞改變、神經(jīng)纖維骨架和突觸結(jié)構(gòu)及其受體密度減少等形態(tài)、代謝及功能變化，以上病理改變導(dǎo)致腦干生命中樞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的應(yīng)急反應(yīng)和代謝效能降低，使大鼠易于失代償性衰竭而死亡。
　　在前期研究工作的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步探討：
　?、怕跃凭卸净铙w大鼠腦部磁共振1H-質(zhì)子振波譜(MRS)和彌散張量成像(DTI)的研究，無創(chuàng)性檢測(cè)腦代謝物Naa、Cr和Cho的含量及神經(jīng)軸索纖維的結(jié)構(gòu)變化，為臨床早期

4、診斷和治療酒精性腦病提供依據(jù)；
　　⑵檢測(cè)慢性酒精中毒及輕微打擊作用下，以及椎管內(nèi)注射NF-κB抑制劑PDTC后腦干核因子NF-κB p65和細(xì)胞因子IL-1β的表達(dá)情況，比較抑制劑PDTC干預(yù)前后灌酒打擊大鼠的死亡率。探討NF-κB p65和細(xì)胞因子IL-1β介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在慢性酒精中毒聯(lián)合腦震蕩打擊導(dǎo)致的大鼠腦部損傷及死亡機(jī)制中的作用。
　　2實(shí)驗(yàn)方法：
　　2.1建立大鼠慢性酒精中毒及腦震蕩打擊模型
　　成

5、年雄性SD大鼠，體重300±50g，隨機(jī)分為灌酒組、灌水組、灌水打擊組及灌酒打擊組，灌酒及灌酒打擊組每日以食用白酒(北京紅星二鍋頭，52％v/v)灌胃4 w，每天9:00、15:00各1次，每次10 ml/kg。灌水及灌水打擊組用自來水取代白酒灌胃，方法同灌酒組。用自制單擺式打擊裝置制作灌水和灌酒大鼠腦震蕩性打擊模型。觀察大鼠灌酒及打擊后的生理變化，統(tǒng)計(jì)打擊后大鼠的死亡率。取慢性灌酒大鼠腦、肝、腎、肺等器官行HE染色，觀察灌酒后各器官的

6、病理變化。用電鏡觀察慢性酒精中毒大鼠及腦震蕩打擊后腦干神經(jīng)纖維微管微絲、髓鞘、神經(jīng)元、線粒體等超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　2.2灌酒結(jié)束后腦震蕩打擊前，大鼠椎管內(nèi)注射NF-κB的抑制劑PDTC
　　用1ml注射器穿刺L5-6椎間隙，緩慢注入100mM（溶于二甲亞砜，DMSO）的PDTC50ul，每天注射一次，共注射兩次，中間間隔一天。
　　2.3灌水組及灌酒組大鼠的核磁共振1H-質(zhì)子波譜(1H-MRS)及彌散張量成像(DTI

7、)掃描
　　灌水組及灌酒組大鼠采用安捷倫(Agilent)7T小動(dòng)物磁共振成像儀進(jìn)行磁共振成像(MRI)掃描，2通道體線圈。后處理軟件：Vnmrj4.0.。
　　T2WI采用fsems系列掃描，氫質(zhì)子波譜(1H-MRS)檢測(cè)區(qū)域?yàn)槟X干，采用press系列掃描。采用LCmodel軟件(version6.2)后處理并定量分析腦干Naa、Cr及 Cho等代謝物的絕對(duì)濃度數(shù)據(jù)。DTI檢測(cè)區(qū)域?yàn)槿X，采用Epip系列掃描。自動(dòng)重建，選

8、取腦干及額葉為感興趣區(qū)，得出ADC、FA圖及數(shù)值。
　　2.4灌水及灌酒大鼠行 Morris水迷宮定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)，記錄大鼠在第四象限的停留時(shí)間和站臺(tái)穿越次數(shù)。分析大鼠慢性灌酒前后以上兩個(gè)指標(biāo)的變化。
　　2.5用免疫熒光、Western blot等方法檢測(cè)各組動(dòng)物腦干活化入核的NF-κB p65表達(dá)情況，用ELISA方法檢測(cè)腦干IL-1β表達(dá)水平。
　　2.6椎管內(nèi)注射NF-κB的抑制劑PDTC，用West

9、ern blot檢測(cè)各組動(dòng)物腦干活化入核的NF-κB p65表達(dá)情況，用ELISA檢測(cè)腦干IL-1β表達(dá)水平。
　　3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS Inc., Chicago, US)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析(One-way ANONA)進(jìn)行均數(shù)比較，LSD檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，方差不齊的用Dunnet’ T3檢驗(yàn)，計(jì)量資料用?x±SD表示；用卡方檢驗(yàn)驗(yàn)(Chi-square test)進(jìn)行非參

10、數(shù)資料比較。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)的顯著性水平定義：p<0.05為差異顯著。
　　4結(jié)果：
　　4.1大鼠行為及體重變化
　　大鼠灌酒早期出現(xiàn)躁動(dòng)、易激惹，逐漸出現(xiàn)昏睡、呼吸緩慢，四肢軟癱等急性醉酒表現(xiàn)。隨著灌酒天數(shù)的增加，大鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡、消瘦、行動(dòng)遲緩、毛發(fā)稀疏、食欲差以及大便稀溏等癥狀，體重逐漸減輕；灌水組大鼠體重逐漸增加，灌酒結(jié)束后兩組動(dòng)物體重差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。灌水大鼠腦震蕩打擊后出現(xiàn)角膜反射消失、對(duì)疼

11、痛刺激無反應(yīng)，四肢強(qiáng)直，1-3分鐘后逐漸恢復(fù)正常；灌酒大鼠腦震蕩打擊后出現(xiàn)角弓反張、全身抽搐，呼吸由深大逐漸變?yōu)闇\慢甚至消失，部分大鼠數(shù)分鐘后死亡。灌酒打擊大鼠死亡率為48%(12/25)；添加抑制劑 PDTC后灌酒打擊大鼠死亡率下降為20%（5/25），差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.05。灌水打擊組動(dòng)物未見死亡。
　　4.2大體標(biāo)本及HE染色結(jié)果
　　⑴灌水組大鼠皮層表面腦溝腦回清晰，未見出血及淤血。顯微鏡下見神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞

12、、神經(jīng)纖維形態(tài)和分布正常。⑵灌水打擊組大體標(biāo)本見皮層表面光滑，腦溝略縮小，腦回稍模糊，未見蛛網(wǎng)膜下腔出血。顯微鏡下見神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞輕度水腫，神經(jīng)纖維不規(guī)則扭曲增粗，部分血管痙攣改變。⑶灌酒組大體標(biāo)本見皮層表面輕度淤血，散在蛛網(wǎng)膜下腔出血。鏡下見神經(jīng)纖維排列疏松、紊亂，局部不規(guī)則增粗，散在暗神經(jīng)元。⑷灌酒打擊組大體標(biāo)本見皮層表面淤血明顯，廣泛蛛網(wǎng)膜下腔出血。暗神經(jīng)元比灌酒組更常見，腦血管痙攣扭曲。神經(jīng)纖維排列紊亂，不規(guī)則增粗、扭曲、甚至

13、斷裂。各組動(dòng)物均未見腦挫裂傷灶。
　　慢性灌酒大鼠其他器官的病理變化：腎小球及間質(zhì)上皮水腫，彌散管型。雙肺彌漫大小不一白色斑塊，鏡下見炎細(xì)胞以細(xì)小支氣管為中心聚集成膿腫灶，相互融合，部分支氣管壁及血管壁被炎癥細(xì)胞破壞。肝淤血腫脹，肝細(xì)胞彌漫脂肪變性，小葉周邊重，實(shí)質(zhì)散在小壞死灶及膿腫灶。胃壁變薄，上皮不規(guī)則壞死脫落，粘膜表面絮狀物質(zhì)附著。
　　4.3電鏡觀察腦干超微結(jié)構(gòu)
　　灌水組神經(jīng)軸索纖維粗細(xì)均勻、形態(tài)規(guī)整，神經(jīng)髓

14、鞘致密、神經(jīng)微管及微絲排列規(guī)則。灌水打擊組神經(jīng)髓鞘散在裂隙樣分層、神經(jīng)軸索纖維排列松散。灌酒組神經(jīng)軸索粗細(xì)不均、排列松散紊亂，神經(jīng)髓鞘不規(guī)則分層，部分見脫髓鞘改變，部分神經(jīng)微管微絲斷裂。灌酒打擊組髓鞘彌漫疏松、板層分離，脫髓鞘改變多見；線粒體腫脹空泡變，線粒體脊斷裂溶解，可見暗神經(jīng)元，大量神經(jīng)骨架纖維斷裂崩解。
　　4.4核磁共振掃描結(jié)果
　　灌酒組和灌水組大鼠腦部常規(guī)核磁共振掃描T2相未見明顯異常。1H-MRS結(jié)果顯示，灌

15、酒組腦干 Naa、Cr和Cho絕對(duì)值均比灌水組小，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)；DTI結(jié)果顯示，灌酒額葉FA值比組灌水組小，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.01；灌酒組腦干FA值比灌水組小，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.05；灌酒組腦干和額葉ADC值和灌水組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p>0.05。
　　4.5 Morris水迷宮結(jié)果
　　灌酒組大鼠和灌水組相比，站臺(tái)穿越次數(shù)明顯減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)；第四項(xiàng)限時(shí)間百分比明顯

16、減小，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。
　　4.6 NF-κB p65免疫組織熒光染色結(jié)果
　　熒光顯微鏡下粉紅色熒光即為活化入核的NF-κB p65蛋白，灌水組和灌水打擊組大鼠散在短桿狀或顆粒狀粉紅色熒光；兩者陽性細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p>0.05。灌酒組大鼠腦干可見彌漫短桿狀或顆粒狀粉紅色熒光，陽性細(xì)胞數(shù)比灌水組和灌水打擊組明顯增多，p<0.01；灌酒打擊組可見彌漫短桿狀或顆粒狀粉紅色熒光，陽性細(xì)胞數(shù)比灌酒組明顯增多

17、，p<0.05。
　　4.7腦干NF-κB Westernblot結(jié)果
　　灌水組NF-κB p65條帶寬度及灰度值與灌水打擊組相當(dāng)，灌酒組條帶明顯比灌水打擊組及灌水組寬，而灌酒打擊組條帶明顯較灌酒組寬。
　　灌酒打擊+PDTC組NF-κB p65條帶明顯比灌酒打擊組窄；灌酒+PDTC組條帶明顯比灌酒組窄。
　　4.8 IL-1βELISA結(jié)果
　　灌水組及灌水打擊組IL-1β表達(dá)水平差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p>

18、0.05；灌酒組腦干IL-1β表達(dá)水平較灌水組及灌水打擊組明顯升高，p<0.01；灌酒打擊組大鼠IL-1β表達(dá)水平較灌酒組明顯升高，p<0.05。
　　灌酒打擊+PDTC組IL-1β表達(dá)水平明顯比灌酒打擊組低，p<0.01；灌酒+PDTC組IL-1β表達(dá)水平明顯比灌酒組低，p<0.01。
　　5結(jié)論：
　　⑴酒精性腦病腦干核磁共振1H-MRS掃描Naa、Cr和Cho等代謝物質(zhì)含量明顯下降，DTI掃描FA值明顯降低，提示

19、1H-MRS及DTI掃描可早期發(fā)現(xiàn)慢性酒精中毒腦部神經(jīng)細(xì)胞代謝物及軸索結(jié)構(gòu)的異常變化，為慢性酒精中毒的臨床診治提供依據(jù)。
　　⑵酒精性腦病額葉DTI掃描FA值降低，結(jié)合大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)站臺(tái)穿越次數(shù)明顯減少，第四項(xiàng)限時(shí)間百分比明顯減小，提示慢性酒精中毒引起的額葉軸索纖維損傷構(gòu)成了大鼠學(xué)習(xí)記憶能力障礙的病理基礎(chǔ)；
　?、蔷凭阅X病腦干核因子NF-κB p65活化及細(xì)胞因子IL-1β表達(dá)增強(qiáng)，腦震蕩性打擊后兩者表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)；而椎管