腦震蕩打擊酒精性腦病大鼠的死亡機制研究.pdf

1、1背景及目的：
　　酗酒嚴重危害人身健康。在慢性酒精中毒的全身性毒理學作用中，腦損害表現(xiàn)最明顯，亦最受人們關注。其常表現(xiàn)為性格改變，精神萎靡，認知障礙，記憶能力下降，甚至出現(xiàn)幻覺、妄想、躁動、抑郁、昏睡或昏迷等癥狀，嚴重者危及生命，稱之為酒精性腦病。在臨床及法醫(yī)實踐中，常遇到慢性酗酒者遭受輕微頭部外傷后，出現(xiàn)嚴重臨床癥狀，甚至死亡，然而其具體機制尚不明了，造成臨床診治及法醫(yī)鑒定的困惑。
　　酒精性腦病者常規(guī)影像學檢測顯示大腦

2、皮質和白質萎縮，腦室腦池擴大，腦溝增寬，胼胝體及腦橋變性等；病理檢查呈大腦及小腦萎縮，腦體積及質量減小。然而，這些臨床-病理改變往往出現(xiàn)于慢性酒精中毒的晚期，甚至病人死后病理檢查才發(fā)現(xiàn)。而酒精性腦病早期臨床診斷，及其相關治療干預一直是人們研究的方向。
　　本課題組前期研究證實，慢性酒精中毒大鼠遭受輕微的腦震蕩性打擊后，死亡率明顯高于慢性灌水-打擊組和急性酒精中毒-打擊組，并發(fā)現(xiàn)了酗酒引起腦血管退變、抑制腦紅蛋白(Ngb)相關氧和能

3、量代謝、鈉鉀泵功能障礙以及腦干神經(jīng)元暗細胞改變、神經(jīng)纖維骨架和突觸結構及其受體密度減少等形態(tài)、代謝及功能變化，以上病理改變導致腦干生命中樞神經(jīng)網(wǎng)絡的應急反應和代謝效能降低，使大鼠易于失代償性衰竭而死亡。
　　在前期研究工作的基礎上，本實驗擬進一步探討：
　　⑴慢性酒精中毒活體大鼠腦部磁共振1H-質子振波譜(MRS)和彌散張量成像(DTI)的研究，無創(chuàng)性檢測腦代謝物Naa、Cr和Cho的含量及神經(jīng)軸索纖維的結構變化，為臨床早期

4、診斷和治療酒精性腦病提供依據(jù)；
　　⑵檢測慢性酒精中毒及輕微打擊作用下，以及椎管內注射NF-κB抑制劑PDTC后腦干核因子NF-κB p65和細胞因子IL-1β的表達情況，比較抑制劑PDTC干預前后灌酒打擊大鼠的死亡率。探討NF-κB p65和細胞因子IL-1β介導的炎癥反應在慢性酒精中毒聯(lián)合腦震蕩打擊導致的大鼠腦部損傷及死亡機制中的作用。
　　2實驗方法：
　　2.1建立大鼠慢性酒精中毒及腦震蕩打擊模型
　　成

5、年雄性SD大鼠，體重300±50g，隨機分為灌酒組、灌水組、灌水打擊組及灌酒打擊組，灌酒及灌酒打擊組每日以食用白酒(北京紅星二鍋頭，52％v/v)灌胃4 w，每天9:00、15:00各1次，每次10 ml/kg。灌水及灌水打擊組用自來水取代白酒灌胃，方法同灌酒組。用自制單擺式打擊裝置制作灌水和灌酒大鼠腦震蕩性打擊模型。觀察大鼠灌酒及打擊后的生理變化，統(tǒng)計打擊后大鼠的死亡率。取慢性灌酒大鼠腦、肝、腎、肺等器官行HE染色，觀察灌酒后各器官的

6、病理變化。用電鏡觀察慢性酒精中毒大鼠及腦震蕩打擊后腦干神經(jīng)纖維微管微絲、髓鞘、神經(jīng)元、線粒體等超微結構的變化。
　　2.2灌酒結束后腦震蕩打擊前，大鼠椎管內注射NF-κB的抑制劑PDTC
　　用1ml注射器穿刺L5-6椎間隙，緩慢注入100mM（溶于二甲亞砜，DMSO）的PDTC50ul，每天注射一次，共注射兩次，中間間隔一天。
　　2.3灌水組及灌酒組大鼠的核磁共振1H-質子波譜(1H-MRS)及彌散張量成像(DTI

7、)掃描
　　灌水組及灌酒組大鼠采用安捷倫(Agilent)7T小動物磁共振成像儀進行磁共振成像(MRI)掃描，2通道體線圈。后處理軟件：Vnmrj4.0.。
　　T2WI采用fsems系列掃描，氫質子波譜(1H-MRS)檢測區(qū)域為腦干，采用press系列掃描。采用LCmodel軟件(version6.2)后處理并定量分析腦干Naa、Cr及 Cho等代謝物的絕對濃度數(shù)據(jù)。DTI檢測區(qū)域為全腦，采用Epip系列掃描。自動重建，選

8、取腦干及額葉為感興趣區(qū)，得出ADC、FA圖及數(shù)值。
　　2.4灌水及灌酒大鼠行 Morris水迷宮定位航行試驗和空間探索試驗，記錄大鼠在第四象限的停留時間和站臺穿越次數(shù)。分析大鼠慢性灌酒前后以上兩個指標的變化。
　　2.5用免疫熒光、Western blot等方法檢測各組動物腦干活化入核的NF-κB p65表達情況，用ELISA方法檢測腦干IL-1β表達水平。
　　2.6椎管內注射NF-κB的抑制劑PDTC，用West

9、ern blot檢測各組動物腦干活化入核的NF-κB p65表達情況，用ELISA檢測腦干IL-1β表達水平。
　　3統(tǒng)計學分析
　　采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件(SPSS Inc., Chicago, US)分析實驗數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析(One-way ANONA)進行均數(shù)比較，LSD檢驗進行組間比較，方差不齊的用Dunnet’ T3檢驗，計量資料用?x±SD表示；用卡方檢驗驗(Chi-square test)進行非參

10、數(shù)資料比較。統(tǒng)計學檢驗的顯著性水平定義：p<0.05為差異顯著。
　　4結果：
　　4.1大鼠行為及體重變化
　　大鼠灌酒早期出現(xiàn)躁動、易激惹，逐漸出現(xiàn)昏睡、呼吸緩慢，四肢軟癱等急性醉酒表現(xiàn)。隨著灌酒天數(shù)的增加，大鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡、消瘦、行動遲緩、毛發(fā)稀疏、食欲差以及大便稀溏等癥狀，體重逐漸減輕；灌水組大鼠體重逐漸增加，灌酒結束后兩組動物體重差別有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。灌水大鼠腦震蕩打擊后出現(xiàn)角膜反射消失、對疼

11、痛刺激無反應，四肢強直，1-3分鐘后逐漸恢復正常；灌酒大鼠腦震蕩打擊后出現(xiàn)角弓反張、全身抽搐，呼吸由深大逐漸變?yōu)闇\慢甚至消失，部分大鼠數(shù)分鐘后死亡。灌酒打擊大鼠死亡率為48%(12/25)；添加抑制劑 PDTC后灌酒打擊大鼠死亡率下降為20%（5/25），差別有統(tǒng)計學意義，p<0.05。灌水打擊組動物未見死亡。
　　4.2大體標本及HE染色結果
　?、殴嗨M大鼠皮層表面腦溝腦回清晰，未見出血及淤血。顯微鏡下見神經(jīng)元、膠質細胞

12、、神經(jīng)纖維形態(tài)和分布正常。⑵灌水打擊組大體標本見皮層表面光滑，腦溝略縮小，腦回稍模糊，未見蛛網(wǎng)膜下腔出血。顯微鏡下見神經(jīng)元及膠質細胞輕度水腫，神經(jīng)纖維不規(guī)則扭曲增粗，部分血管痙攣改變。⑶灌酒組大體標本見皮層表面輕度淤血，散在蛛網(wǎng)膜下腔出血。鏡下見神經(jīng)纖維排列疏松、紊亂，局部不規(guī)則增粗，散在暗神經(jīng)元。⑷灌酒打擊組大體標本見皮層表面淤血明顯，廣泛蛛網(wǎng)膜下腔出血。暗神經(jīng)元比灌酒組更常見，腦血管痙攣扭曲。神經(jīng)纖維排列紊亂，不規(guī)則增粗、扭曲、甚至

13、斷裂。各組動物均未見腦挫裂傷灶。
　　慢性灌酒大鼠其他器官的病理變化：腎小球及間質上皮水腫，彌散管型。雙肺彌漫大小不一白色斑塊，鏡下見炎細胞以細小支氣管為中心聚集成膿腫灶，相互融合，部分支氣管壁及血管壁被炎癥細胞破壞。肝淤血腫脹，肝細胞彌漫脂肪變性，小葉周邊重，實質散在小壞死灶及膿腫灶。胃壁變薄，上皮不規(guī)則壞死脫落，粘膜表面絮狀物質附著。
　　4.3電鏡觀察腦干超微結構
　　灌水組神經(jīng)軸索纖維粗細均勻、形態(tài)規(guī)整，神經(jīng)髓

14、鞘致密、神經(jīng)微管及微絲排列規(guī)則。灌水打擊組神經(jīng)髓鞘散在裂隙樣分層、神經(jīng)軸索纖維排列松散。灌酒組神經(jīng)軸索粗細不均、排列松散紊亂，神經(jīng)髓鞘不規(guī)則分層，部分見脫髓鞘改變，部分神經(jīng)微管微絲斷裂。灌酒打擊組髓鞘彌漫疏松、板層分離，脫髓鞘改變多見；線粒體腫脹空泡變，線粒體脊斷裂溶解，可見暗神經(jīng)元，大量神經(jīng)骨架纖維斷裂崩解。
　　4.4核磁共振掃描結果
　　灌酒組和灌水組大鼠腦部常規(guī)核磁共振掃描T2相未見明顯異常。1H-MRS結果顯示，灌

15、酒組腦干 Naa、Cr和Cho絕對值均比灌水組小，差別有統(tǒng)計學意義(p<0.01)；DTI結果顯示，灌酒額葉FA值比組灌水組小，差別有統(tǒng)計學意義，p<0.01；灌酒組腦干FA值比灌水組小，差別有統(tǒng)計學意義，p<0.05；灌酒組腦干和額葉ADC值和灌水組差別無統(tǒng)計學意義，p>0.05。
　　4.5 Morris水迷宮結果
　　灌酒組大鼠和灌水組相比，站臺穿越次數(shù)明顯減少，差別有統(tǒng)計學意義(p<0.01)；第四項限時間百分比明顯

16、減小，差別有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。
　　4.6 NF-κB p65免疫組織熒光染色結果
　　熒光顯微鏡下粉紅色熒光即為活化入核的NF-κB p65蛋白，灌水組和灌水打擊組大鼠散在短桿狀或顆粒狀粉紅色熒光；兩者陽性細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義，p>0.05。灌酒組大鼠腦干可見彌漫短桿狀或顆粒狀粉紅色熒光，陽性細胞數(shù)比灌水組和灌水打擊組明顯增多，p<0.01；灌酒打擊組可見彌漫短桿狀或顆粒狀粉紅色熒光，陽性細胞數(shù)比灌酒組明顯增多

17、，p<0.05。
　　4.7腦干NF-κB Westernblot結果
　　灌水組NF-κB p65條帶寬度及灰度值與灌水打擊組相當，灌酒組條帶明顯比灌水打擊組及灌水組寬，而灌酒打擊組條帶明顯較灌酒組寬。
　　灌酒打擊+PDTC組NF-κB p65條帶明顯比灌酒打擊組窄；灌酒+PDTC組條帶明顯比灌酒組窄。
　　4.8 IL-1βELISA結果
　　灌水組及灌水打擊組IL-1β表達水平差別無統(tǒng)計學意義，p>

18、0.05；灌酒組腦干IL-1β表達水平較灌水組及灌水打擊組明顯升高，p<0.01；灌酒打擊組大鼠IL-1β表達水平較灌酒組明顯升高，p<0.05。
　　灌酒打擊+PDTC組IL-1β表達水平明顯比灌酒打擊組低，p<0.01；灌酒+PDTC組IL-1β表達水平明顯比灌酒組低，p<0.01。
　　5結論：
　?、啪凭阅X病腦干核磁共振1H-MRS掃描Naa、Cr和Cho等代謝物質含量明顯下降，DTI掃描FA值明顯降低，提示

19、1H-MRS及DTI掃描可早期發(fā)現(xiàn)慢性酒精中毒腦部神經(jīng)細胞代謝物及軸索結構的異常變化，為慢性酒精中毒的臨床診治提供依據(jù)。
　?、凭凭阅X病額葉DTI掃描FA值降低，結合大鼠水迷宮實驗站臺穿越次數(shù)明顯減少，第四項限時間百分比明顯減小，提示慢性酒精中毒引起的額葉軸索纖維損傷構成了大鼠學習記憶能力障礙的病理基礎；
　?、蔷凭阅X病腦干核因子NF-κB p65活化及細胞因子IL-1β表達增強，腦震蕩性打擊后兩者表達進一步增強；而椎管