HB-EGF對(duì)大鼠腸道淤血再灌注及肝臟缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究.pdf

1、在肝臟外科，為減少手術(shù)過(guò)程中的出血常需阻斷第一肝門(mén)，這勢(shì)必造成肝臟缺血和腸道淤血，而隨后的肝門(mén)開(kāi)放，則不可避免地造成肝臟的缺血再灌注損傷及腸道的淤血再灌注損傷。在肝臟移植領(lǐng)域，也不可避免地會(huì)涉及到這些損傷。如何有效地減輕這些損傷，一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。
　　 肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子(Heparin-binding epidermal growthfactor-like growth factor，HB-EGF)作為

2、一種細(xì)胞保護(hù)因子對(duì)組織器官起保護(hù)作用，近年來(lái)越來(lái)越受到關(guān)注。HB-EGF是表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor，EGF)家族中的一員。后來(lái)的研究表明，HB-EGF基因廣泛表達(dá)，HB-EGF可減少氧自由基的產(chǎn)生，并對(duì)多種細(xì)胞具有促有絲分裂的作用。
　　 HB-EGF可以減輕大鼠腸道缺血再灌注損傷時(shí)的細(xì)菌移位和炎癥因子的表達(dá)，可增加壞死性腸炎時(shí)腸道微血管血流量，改善失血性休克后腸道的微循環(huán)。肝臟方面，HB-E

3、GF在大鼠肝臟部分切除后可通過(guò)旁分泌的方式促進(jìn)肝臟的再生，轉(zhuǎn)基因小鼠模型實(shí)驗(yàn)也證實(shí)該因子可以促進(jìn)肝切除術(shù)后的肝臟再生。有研究認(rèn)為HB-EGF對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)和促有絲分裂能力比肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子更強(qiáng)。大鼠腸道發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)，腸管內(nèi)注射HB-EGF對(duì)肺也起到保護(hù)作用。
　　 HB-EGF對(duì)腸道缺血再灌注損傷保護(hù)作用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究多是通過(guò)阻斷腸系膜上動(dòng)脈血供的方法進(jìn)行，但HB-EGF對(duì)肝門(mén)阻斷后腸道淤血損傷的保護(hù)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。研究表

4、明，淤血性損傷較缺血性損傷更為嚴(yán)重、損傷恢復(fù)更為緩慢。淤血與缺血存在不同之處，因此淤血再灌注損傷過(guò)程與缺血再灌注損傷亦有不同。
　　 針對(duì)肝臟缺血再灌注損傷及腸道淤血再灌注損傷這一常見(jiàn)的臨床問(wèn)題，并鑒于HB-EGF對(duì)腸系膜上動(dòng)脈阻斷所致的腸道缺血再灌注損傷有比較確切的保護(hù)作用，而目前尚未見(jiàn)HB-EGF對(duì)腸道淤血再灌注損傷保護(hù)作用的研究，其對(duì)肝臟缺血再灌注損傷有無(wú)保護(hù)作用也未見(jiàn)報(bào)道，我們?cè)O(shè)計(jì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)的研究。我們采用Prin

5、gle's法建立第一肝門(mén)阻斷的大鼠模型，觀察HB-EGF是否可以減輕腸道的淤血再灌注損傷。更進(jìn)一步的研究，我們模擬肝臟移植手術(shù)，建立經(jīng)門(mén)靜脈灌注的大鼠自體肝臟移植模型，觀察HB-EGF對(duì)肝臟缺血再灌注損傷是否也起保護(hù)作用，并從炎癥反應(yīng)的角度對(duì)HB-EGF保護(hù)肝臟的機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　 第一章:HB-EGF對(duì)大鼠腸道淤血再灌注損傷保護(hù)作用的研究
　　 目的:
　　 探討HB-EGF是否對(duì)第一肝門(mén)阻斷所造成的大鼠

6、腸道淤血再灌注損傷起保護(hù)作用。
　　 材料和方法:
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料
　　 雄性Sprague-Dawley大鼠，樣本量為30只，周齡7～9周，體重213-256 g。清潔級(jí)，飼養(yǎng)條件符合SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。HB-EGF購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司。
　　 2.動(dòng)物模型的建立
　　 大鼠術(shù)前禁食12小時(shí)，不禁水。采用乙醚吸入麻醉，備皮消毒后取腹部正中縱行切口入

7、腹。顯露第一肝門(mén)，Pringle's法阻斷第一肝門(mén)，30分鐘后去除血管夾，關(guān)腹。再灌注6小時(shí)后再次經(jīng)原切口開(kāi)腹取腸道、血清標(biāo)本。
　　 3.實(shí)驗(yàn)分組
　　 30只SD大鼠隨機(jī)分成3組:假手術(shù)組（Sham，n=10），腸道淤血再灌注組(C/R，n=10)和HB-EGF治療組(C/R+HB-EGF，n=10)。
　　 假手術(shù)組給予除夾閉第一肝門(mén)以外的上述同樣平行處理。HB-EGF治療組在第一肝門(mén)阻斷15分鐘時(shí)，經(jīng)空腸

8、-回腸交界處向腸管內(nèi)注入HB-EGF(劑量為600μg/kg，與含0.1％ BSA的PBS液配成1 ml)。腸道淤血再灌注組在同一時(shí)間以同樣的方法注入1ml含0.1％ BSA的PBS液。
　　 4.觀察指標(biāo)
　　 4.1腸道組織病理學(xué)觀察
　　 取末段回腸，組織經(jīng)甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋與切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。并根據(jù)其病理?yè)p傷程度評(píng)分（Chiu評(píng)分）。
　　 4.2血清炎癥因子的含量
　　

9、 經(jīng)下腔靜脈取血，采用ELISA法測(cè)定各組血清標(biāo)本中TNF-α和IL-1β的含量。
　　 4.3腸道組織髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性
　　 4.4腸道組織丙二醛(MDA)含量
　　 硫代巴比妥酸法測(cè)定腸道組織MDA含量
　　 4.5腸道上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）
　　 采用TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法（Terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated

10、deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling assay,TUNEL)檢測(cè)腸道上皮細(xì)胞凋亡情況，凋亡指數(shù)定義為T(mén)UNEL陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 數(shù)據(jù)均以(x)±s表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。多組頻數(shù)表資料的比較采用Kruskal-Wallis H。多組均數(shù)方差齊性，采用單因素方差分析(one-wayANOVA)及LSD兩

11、兩比較;多組均數(shù)方差不齊，采用Welch近似方差分析及Dunnett's T3兩兩比較。統(tǒng)計(jì)分析中，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1.腸道組織病理學(xué)改變
　　 Sham組腸粘膜未見(jiàn)損傷;C/R組可見(jiàn)絨毛頂端下間隙增寬，部分絨毛脫落、破潰以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);與C/R組相比，C/R+HB-EGF組回腸組織的病理?yè)p傷明顯減輕。C/R+HB-EGF組回腸組織Chiu病理評(píng)分顯著低于C/R組(P=0.002)

12、。
　　 2.血清炎癥因子TNF-α和IL-1β的含量
　　 C/R組血清TNF-α和IL-1β的含量顯著高于Sham組(P=0.000，P=0.000);C/R+HB-EGF組TNF-α和IL-1β的含量顯著低于C/R組(P=0.031，P=0.038)。
　　 3.腸道組織MPO活性
　　 假手術(shù)組、腸道淤血再灌注組、HB-EGF治療組的MPO活性分別為(0.49±0.10)、（1.28±0.18）和

13、（0.89±0.15）U/g。腸道淤血再灌注組MPO活性顯著高于假手術(shù)組(P=0.000)，HB-EGF治療組MPO活性顯著低于腸道淤血再灌注組(P=0.000)。
　　 4.腸道組織MDA含量
　　 假手術(shù)組、腸道淤血再灌注組、HB-EGF治療組的MDA含量分別為(1.32±0.23)、（3.05±0.39）和（2.39±0.27）nmol/mg protein。腸道淤血再灌注組MDA含量顯著高于假手術(shù)組(P=0.00

14、0)，HB-EGF治療組MDA含量顯著低于腸道淤血再灌注組(P=0.000)。
　　 5.腸道上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)
　　 腸道上皮細(xì)胞呈現(xiàn)棕褐色者為T(mén)UNEL陽(yáng)性細(xì)胞。假手術(shù)組、腸道淤血再灌注組、HB-EGF治療組的AI分別為（7.83±2.01）、（66.08±10.61）和(51.22±9.98)％。腸道淤血再灌注組AI顯著高于假手術(shù)組(P=0.000)，HB-EGF治療組AI顯著低于腸道淤血再灌注組(P=0.0

15、14)。
　　 結(jié)論:
　　 1.本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜅l件下，大鼠腸道淤血30分鐘再灌注6小時(shí)可造成顯著的淤血再灌注損傷。
　　 2.腸管內(nèi)HB-EGF給藥可以減輕腸道的淤血再灌注損傷，其保護(hù)作用體現(xiàn)在HB-EGF可減輕腸道組織的病理?yè)p傷、降低炎癥因子的表達(dá)、減少組織中炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、減輕腸道組織的氧化應(yīng)激損傷以及抑制腸道上皮細(xì)胞的凋亡。
　　 第二章:HB-EGF對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究
　　

16、 目的:
　　 模擬肝臟移植手術(shù)，建立穩(wěn)定的大鼠全肝缺血再灌注損傷模型。觀察該模型條件下HB-EGF是否對(duì)肝臟也起保護(hù)作用，并對(duì)HB-EGF保護(hù)肝臟的機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　 材料和方法:
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料
　　 雄性Sprague-Dawley大鼠，樣本量為30只，周齡7～9周，體重217-255 g。清潔級(jí)，飼養(yǎng)條件符合SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。HB-EGF購(gòu)自美國(guó)R&D

17、Systems公司。
　　 2.大鼠自體肝移植模型（全肝血流阻斷+經(jīng)門(mén)靜脈灌注）的建立
　　 大鼠術(shù)前禁食12小時(shí)，不禁水。采用乙醚吸入麻醉，備皮消毒后取腹部正中縱行切口入腹。分離切斷肝周韌帶，充分游離肝臟;結(jié)扎并切斷左膈下靜脈、肝食管韌帶靜脈和右腎上腺靜脈;游離肝上下腔靜脈和肝下下腔靜脈;打開(kāi)肝十二指腸韌帶，解剖第一肝門(mén)，游離門(mén)靜脈、肝動(dòng)脈和膽總管。至此除了出入肝臟的管道，肝臟已經(jīng)完全游離。
　　 無(wú)創(chuàng)血管夾夾

18、閉門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈，并開(kāi)始計(jì)時(shí);穿刺針順血流方向刺入門(mén)靜脈并予血管夾固定穿刺針，經(jīng)穿刺針注射2ml肝素鹽水(35 U/ml)使大鼠全身肝素化;阻斷肝上下腔靜脈和肝下下腔靜脈，并在肝下下腔靜脈的血管夾上方剪開(kāi)約1mm的靜脈壁作為流出道。4℃含肝素(12.5 U/ml)的乳酸林格液(20ml)以2.5 ml/min的速度通過(guò)輸液泵經(jīng)穿刺針行門(mén)靜脈灌注，在灌注的同時(shí)以4℃乳酸林格液澆注肝臟表面降溫。
　　 灌注完成后拔出門(mén)靜脈穿刺針，9

19、-0 prolene線修補(bǔ)門(mén)靜脈穿刺點(diǎn)，8-0prolene線修補(bǔ)肝下下腔靜脈流出道;計(jì)時(shí)滿(mǎn)30分鐘后解除所有血管夾，結(jié)束無(wú)肝期;肝臟表面予38℃生理鹽水澆注以快速?gòu)?fù)溫;關(guān)腹。
　　 再灌注6小時(shí)后再次經(jīng)原切口開(kāi)腹取肝臟、血清標(biāo)本。
　　 3.實(shí)驗(yàn)分組
　　 30只SD大鼠隨機(jī)分成3組:假手術(shù)組(Sham，n=10)，肝臟缺血再灌注組(I/R，n=10)和HB-EGF治療組(I/R+HB-EGF，n=10)。

20、r>　　 假手術(shù)組只將肝臟完全游離，不行血管穿刺、阻斷。HB-EGF治療組在門(mén)靜脈阻斷15分鐘時(shí)，經(jīng)空腸-回腸交界處向腸管內(nèi)注入HB-EGF(劑量為600μg/kg，與含0.1％BSA的PBS液配成1ml)。肝臟缺血再灌注組在同一時(shí)間以同樣的方法注入1ml含0.1％ BSA的PBS液。
　　 4.觀察指標(biāo)
　　 4.1血清ALT水平
　　 4.2肝臟組織病理學(xué)觀察
　　 取右葉肝臟，組織經(jīng)甲醛固定，常規(guī)

21、石蠟包埋與切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。并根據(jù)其病理?yè)p傷程度評(píng)分（Suzuki評(píng)分）。
　　 4.3肝細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)
　　 4.4肝臟組織髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性
　　 4.5炎癥因子的含量
　　 經(jīng)下腔靜脈取血，采用ELISA法測(cè)定各組血清標(biāo)本中TNF-α和IL-1β水平的變化。肝臟組織勻漿后ELISA法測(cè)定各組肝臟組織中TNF-α和IL-1β的含量。
　　 4.6肝臟組織細(xì)胞間粘附

22、分子-1（ICAM-1）免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組肝臟組織ICAM-1的表達(dá)情況。
　　 4.7肝臟組織核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65(NF-κB p65)和NF-κB抑制因子α(IκBα)蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blotting）法檢測(cè)各組肝臟核蛋白中NF-κB p65的表達(dá)情況以及總蛋白中IκBα的含量。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 數(shù)據(jù)均以(x)±s表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。多組均數(shù)方差齊性，采

23、用單因素方差分析(one-way ANOVA)及LSD兩兩比較;多組均數(shù)方差不齊，采用Welch近似方差分析及Dunnett's T3兩兩比較。統(tǒng)計(jì)分析中，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1.血清ALT水平
　　 I/R組血清ALT水平顯著高于Sham組（P=0.000），I/R+HB-EGF組血清ALT水平顯著低于I/R組(P=0.034)。
　　 2.肝臟組織病理學(xué)改變
　　 S

24、ham組肝臟未見(jiàn)損傷;I/R組可見(jiàn)明顯的肝細(xì)胞腫脹、胞漿空泡形成、肝竇充血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn);與I/R組相比，I/R+HB-EGF組肝臟的病理?yè)p傷明顯減輕。I/R+HB-EGF組肝臟Suzuki病理評(píng)分顯著低于I/R組(P=0.045)。
　　 3.肝細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）
　　 肝細(xì)胞呈現(xiàn)棕褐色者為T(mén)UNEL陽(yáng)性細(xì)胞。Sham組、I/R組和I/R+HB-EGF組的AI分別為(1.55±0.52)、(14.72±1.98)和(

25、12.18±1.82)％。I/R組AI顯著高于Sham組(P=0.000)，I/R+HB-EGF組AI顯著低于I/R組(P=0.023)。
　　 4.炎癥因子TNF-α和IL-1β的含量
　　 I/R組血清TNF-α和IL-1β水平顯著高于Sham組(P=0.000，P=0.000);I/R+HB-EGF組TNF-α和IL-1β水平顯著低于I/R組(P=0.013，P=0.027)。
　　 I/R組肝臟組織TNF

26、-α和IL-1β的含量顯著高于Sham組(P=0.000，P=0.000);I/R+HB-EGF組TNF-α和IL-1β的含量顯著低于I/R組(P=0.045，P=0.023)。
　　 5.肝臟組織MPO活性
　　 Sham組、I/R組和I/R+HB-EGF組的MPO活性分別為（0.88±0.10）、(1.87±0.13）和（1.72±0.11）U/g。I/R組MPO活性顯著高于Sham組(P=0.000)，I/R+HB

27、-EGF組MPO活性顯著低于I/R組(P=0.005)。
　　 6.肝臟組織細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）的表達(dá)
　　 Sham組未見(jiàn)或僅見(jiàn)微量的ICAM-1表達(dá);I/R組ICAM-1的表達(dá)顯著增加，尤其是在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和中央靜脈內(nèi)皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá);HB-EGF可明顯下調(diào)ICAM-1在肝臟的表達(dá)。
　　 7.肝臟組織核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65(NF-κB p65)和NF-κ3抑制因子α（IκBα）的表達(dá)

28、>　　 與Sham組相比，I/R組肝臟核蛋白中NF-κB p65的表達(dá)顯著增強(qiáng)(P=0.000)，HB-EGF可顯著抑制I/R大鼠肝臟核蛋白中NF-κB p65的表達(dá)(P=0.000)。
　　 與Sham組相比，I/R組肝臟中IκBα的含量顯著降低(P=0.000)，而HB-EGF給藥后顯著提高了I/R大鼠肝臟總蛋白中IκBα的含量(P=0.000)。
　　 結(jié)論:
　　 1.HB-EGF可以減輕大鼠自體肝移植