植物酯酶的純化及其快速檢測農(nóng)藥殘留的研究.pdf

1、本論文以遼春9號小麥面粉為植物酯酶(plantesterase,P-E)的提取原料，利用植物酯酶活性可被有機磷農(nóng)藥所抑制的毒理機制，提取純化一種靈敏度及純度高的植物酯酶。植物酯酶可水解醋酸萘酯為萘酚和醋酸，萘酚與固藍B鹽反應(yīng)生成紫紅色偶氮化合物，從而完成顯色反應(yīng)。當(dāng)樣品中含有機磷農(nóng)藥時，植物酯酶的活性就被抑制，就不能完成顯色反應(yīng)。 植物酯酶粗酶液提取方法的具體步驟為：稱取1g小麥面粉，加入5mLpH值6.5的磷酸緩沖溶液，在30

2、℃恒溫水浴搖床上振蕩提取40min，然后用高速冷凍離心機在4℃下離心5min(10,000rpm)，所得上清液即為植物酯酶粗酶液。將所得粗酶液保存在4℃冰箱(或?qū)⒚敢悍盅b后在真空冷凍干燥機上干成酶干粉冰凍保存)。通過實驗得：粗酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，最適反應(yīng)pH為6.5，10％粗酶最適反應(yīng)時間為10min。雙水相法萃取植物酯酶的最適條件是：10g的雙水相體系中含有13％的硫酸銨，27％的聚乙二醇1000，1mL的植物酯酶粗酶液，1mL

3、pH值為7.5的磷酸緩沖溶液和雙重蒸餾水。在此條件下提取的植物酯酶分配系數(shù)Ke達到10.2462，總蛋白的分配系數(shù)Kp為2.3160，酶活回收率η為94.8％，，萃取效果最佳。 粗酶液經(jīng)過DEAE-纖維素52、SephadexG-200柱層析，第一組分純化了4.9771倍，活力回收20.09％;第二組分純化了1.5276倍，活力回收8.55％。通過實驗確定了植物酯酶的純化條件：以雙重蒸餾水平衡DEAE-纖維素柱2-5h，上樣后，

4、分別以雙重蒸餾水、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/的NaCl進行梯度洗脫，通過酯酶的顯色反應(yīng)可知雙重蒸餾水及0.2mol/LNaCl洗脫得兩組分為所需酶液；以0.2mol/L的NaCl為平衡液將SephadexG-200柱平衡2-5h，將經(jīng)DEAE-52柱層析所得兩組分分別上樣后，以0.2mol/L的NaCl溶液進行洗脫分別得三個組分，其中所得第一組分均為所需組分。 比較了雙

5、水相萃取植物酯酶和柱層析純化植物酯酶的純化倍數(shù)，其中雙水相萃取法酶的純化倍數(shù)是7.6772倍左右，柱層析純化植物酯酶的純化倍數(shù)是4.9771倍左右。粗酶液、雙水相萃取酶液、經(jīng)DEAE-52所得兩組分及SephadexG-200所得的六個組分經(jīng)聚丙烯酰銨電泳看其純度。最終確定所提取植物酯酶的分子量在29KD左右。植物酯酶的檢測系統(tǒng)的最適條件是：底物乙酸-1-萘酯0.1mL，顯色劑固藍B鹽0.9mL，酶液1.0mL，pH值6.5的磷酸緩沖溶

6、液1.0mL，雙重蒸餾水1.0mL，反應(yīng)溫度是40℃，反應(yīng)時間是10min。 采用丙酮做溶劑分別將五種有機磷農(nóng)藥配制成W=1％的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后采用梯度稀釋法在雙重蒸餾水中分別配制10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11(V/V)的系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用提取出來不同純化程度的酶液分別進行檢測試驗，待反應(yīng)完成后用10％抑制率，分別確定出各種酶液的最低農(nóng)藥濃度，結(jié)果如下：粗酶及10％粗酶的檢出限均為10-6