基于人工表達(dá)乙酰膽堿酯酶的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測方法.pdf

1、分類號UDC密級編號碩士碩士學(xué)位論文學(xué)位論文基于人工表達(dá)乙酰膽堿酯酶的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測方法TheganophosphusPesticideResidueDetectionMethodbasedonArtificialExpressionofAChE2016年05月學(xué)位申請人：學(xué)位申請人：王晶王晶指導(dǎo)教師：指導(dǎo)教師：張改平張改平教授、侯玉澤教授、侯玉澤教授教授一級學(xué)科：一級學(xué)科：生物學(xué)生物學(xué)二級學(xué)科：二級學(xué)科：食品生物技術(shù)食品生物技術(shù)學(xué)

2、位類別：學(xué)位類別：理學(xué)碩士理學(xué)碩士摘要摘要近年來，由于有機(jī)磷農(nóng)藥的大面積施用，導(dǎo)致食品、水、環(huán)境中的殘留越來越嚴(yán)重。有機(jī)磷農(nóng)藥通過抑制生物體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的活性而起到毒性作用，極易對人體或動物造成急性中毒。中毒后會造成以神經(jīng)系統(tǒng)損害為主的一系列傷害，包括運(yùn)動功能障礙、記憶認(rèn)知能力下降等一系列的疾病，如帕金森病、阿爾茨海默病。我國出臺了一系列的法律來限制或禁止部分高毒性的有機(jī)磷農(nóng)藥使用，并對食品中有機(jī)磷農(nóng)藥最大殘留量進(jìn)行規(guī)定。目前，有機(jī)磷

3、類農(nóng)藥的檢測方法主要有：氣相色譜法、高效液相色譜法、色譜和質(zhì)譜聯(lián)用法、薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法、酶抑制法、免疫分析法、生物傳感器法等。這些檢測方法精確且定量，但需要精密的儀器設(shè)備和良好的操作人員，因此需要研發(fā)出高效快捷的農(nóng)殘檢測方法。本研究主要運(yùn)用人工表達(dá)乙酰膽堿酯酶，可以大批量制備靈敏度較高，純度較好且具有一定生物酶活性的蛋白，適用于部分有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留檢測。實(shí)驗研究的主要內(nèi)容及結(jié)果如下：1.乙酰膽堿酯酶的人工表達(dá)根據(jù)AChE基因序列

4、，設(shè)計并合成特異性引物，利用PCR擴(kuò)增技術(shù)，得到穩(wěn)定的cDNA片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物與克隆載體連接，構(gòu)建克隆表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)PCR鑒定，雙酶切鑒定和測序分析后，成功將基因片段導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。超聲破碎后，大部分目的蛋白以包涵體形式存在于沉淀中，小部分的目的蛋白以可溶性方式表達(dá)。通過純化和復(fù)性，分別得到所需的目的蛋白。2.有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的ELISA方法采用EDC法成功合成包被原，即甲胺磷BSA，并用

5、作間接ELISA反應(yīng)。成功用HRP標(biāo)記小分子農(nóng)藥，得到甲胺磷HRP，用于直接ELISA中競爭反應(yīng)的標(biāo)記物。間接ELISA中，最適包被抗原選擇1:1000倍稀釋，抗體的最佳工作濃度為1:2000倍稀釋。選擇1%BSA對板進(jìn)行封閉，37℃恒溫反應(yīng)1h。加入顯色底物后反應(yīng)10min，立即用2molLH2SO4終止反應(yīng)。直接ELISA中，選擇pH值在6.0左右的TrisHCl作為實(shí)驗的緩沖溶液，純化的蛋白上清以1:100倍稀釋后包被，對應(yīng)酶標(biāo)物