CyclinG2抑制細胞增殖的實驗研究.pdf

1、中國醫(yī)科大學博士學位論文CyclinG2抑制細胞增殖的實驗研究姓名：田玉樓申請學位級別：博士專業(yè)：細胞生物學指導教師：張學2002.4.1般而言，周期蛋白是細胞周期的正調(diào)節(jié)因子，促進細胞增殖。目前，eycKnG2的功能及調(diào)節(jié)機制尚不明確。根據(jù)現(xiàn)有研究資料分析，cyclinG2司能不同于典型的對細胞增殖起正調(diào)節(jié)作用的周期蛋自，屙可能對細胞周期起負性調(diào)節(jié)作用，抑制細胞增殖。為了驗證這一假設l『本研究首先應用RT—PCR方法克隆了cyclin

2、G2基因eDNA，并構建了真核表達載體，進一步應用脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)染技術，以體外培養(yǎng)的腫瘤細胞系HeLa細胞和正常細胞系CV一1細胞作為受體細胞，進行轉(zhuǎn)基因表達的研究，觀察并研究cyclinG2高表達對細胞體外增殖的影響，并應用免疫細胞化學技術對其調(diào)節(jié)機制進行了初步探討。(首先，根據(jù)美國NCBIGenBank中已知cyclinG2基因eDNA序列設計引物：以人口腔癌前上皮細胞系POFA總RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)產(chǎn)物為模板，應用PCR方法

3、擴增得到了1070bp的特異片段，經(jīng)純化、酶切、連接到載體pcDNAB的BamHI和XbaI酶切位點上，轉(zhuǎn)化EColiJMl09感受態(tài)細胞，菌落PCR及酶切鑒定重組陽性克隆，并進行核苷酸序列分析，證實所得eyclinG2克隆eDNA順序和開放閱讀框架(OpenReadingFrame，ORF)都正確。為了確保eyclinG2基因與載體的選擇性標記基因neo能在受體細胞內(nèi)從單一轉(zhuǎn)錄本翻譯表達，我們又進一步將cyclinG2eDNA亞克隆至

4、含內(nèi)部核糖體進入位點(InternalRibosomeEnⅡySite，IRES)的質(zhì)粒plRESneo的BamHI和BstXI酶切位點上，構建了真核表達載體pIRES—G2。pIKES—G2中cyclinG2的順序再次經(jīng)核苷酸序列分析確認。在本文中，我們將cy—clinG2eDNA克隆到雙順反子真核表達載體plRESneo后進行基因轉(zhuǎn)染實驗，可確保G418篩選后的生存細胞均表達目的基因。載體plKESneo帶有腦心肌炎病毒的IRES順

5、序，IRES將插入的目的基因eyelinG2與載體本身的選擇性標記基因neo兩個0RF隔開，使plRES—G2重組質(zhì)粒在受體細胞內(nèi)僅產(chǎn)生單一轉(zhuǎn)錄本，兩種蛋白質(zhì)同時翻譯表達。plRESnoo的應用克服了應用peDNA3等真核表達載體時目的基因與載體本身的篩選標記基因由于分別獨立轉(zhuǎn)錄和翻譯而不一定同時表達的缺點。繼之，以人宮頸癌細胞系HeLa及非洲綠猴腎細胞系CV一1為受體細胞進行基因轉(zhuǎn)染實驗。應用脂質(zhì)體介導法將pIPES—G2分別轉(zhuǎn)染至H