茉莉酸甲酯對人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞生長抑制作用及其機(jī)制的實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　涎腺腺樣囊性癌(Salivary Adenoid Cystic Carcinoma，SACC)是較為常見的涎腺惡性腫瘤之一，好發(fā)于小涎腺及大涎腺中較小的腺體，約占涎腺上皮性腫瘤的11％，約占涎腺惡性腫瘤的27％。可發(fā)生于任何年齡，以40～60歲居多，無明顯性別差異。SACC生長緩慢，侵襲性強(qiáng)，容易向神經(jīng)、血管和骨呈浸潤和破壞性生長，術(shù)后常有復(fù)發(fā)。SACC區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移少見，可發(fā)生肺、骨、腦和肝等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，致患者術(shù)后

2、生存率低，預(yù)后較差。因此，尋找針對SACC的新療法和低毒高效的抗癌藥物勢在必行。
　　植物激素(plant hormone)又稱植物天然激素或植物內(nèi)源性激素，是一類有機(jī)物質(zhì)，由植物自身代謝產(chǎn)生，自產(chǎn)生部位移動到作用部位，在極低濃度下就可顯示出明顯的生理效應(yīng)。茉莉酸(Jasmonic Acid，JA)及其甲酯(MethylJasmonate，Me-Ja)在植物界廣泛存在，已被第16屆（1999年）國際植物生長會議接受為新一類的植物激

3、素，是調(diào)節(jié)高等植物發(fā)育、應(yīng)答外界刺激（尤其是創(chuàng)傷）、調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一類內(nèi)源性信號分子。近年來的研究表明，JA可致使人淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞Molt-4株死亡，抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株、黑色素瘤SK-28細(xì)胞株和前列腺癌LNcaP細(xì)胞株增殖，而Me-Ja能夠?qū)е乱陨细鞣N細(xì)胞株死亡。Me-Ja還能抑制口腔鱗癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。鑒于不同細(xì)胞對其敏感性存在差異，本研究選擇人涎腺腺樣囊性癌ACC-2細(xì)胞株進(jìn)行

4、實驗，觀察Me-Ja對ACC-2細(xì)胞的作用，為其治療SACC提供實驗理論依據(jù)。
　　目的:
　　本課題以腺樣囊性癌ACC-2細(xì)胞為研究對象，通過體外實驗研究，從細(xì)胞和分子水平上觀察Me-Ja對ACC-2細(xì)胞株的作用，探討其可能存在的機(jī)制，為Me-Ja抗SACC作用的進(jìn)一步研究提供理論以及實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.體外培養(yǎng)ACC-2細(xì)胞，運用CCK-8法篩選茉莉酸甲酯的有效作用濃度及增值抑制率測定;倒置顯微鏡

5、觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化;透射電鏡下觀察各組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu);流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布。
　　2.應(yīng)用RT-PCR技術(shù)及免疫細(xì)胞化學(xué)SP法分別檢測各組ACC-2細(xì)胞中Bcl-2、BaxmRNA和蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。
　　3.實驗分組:空白對照組、5-Fu組、Me-Ja組、Me-Ja+5-Fu組。
　　結(jié)果:
　　1.CCK-8法檢測各濃度梯度Me-Ja作用不同時間對ACC-2細(xì)胞增殖抑制率結(jié)果:Me-Ja對ACC-2細(xì)胞

6、具有增殖抑制作用，這種作用隨Me-Ja作用濃度的增加、作用時間的延長而增大，呈現(xiàn)濃度和時間依賴性。
　　2.Me-Ja對ACC-2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50結(jié)果:Me-Ja對ACC-2細(xì)胞半數(shù)抑制濃度IC50為9.20μmol/L。后續(xù)試驗Me-Ja濃度采用1/2IC50，即4.6μmol/L。
　　3.倒置顯微鏡下觀察Me-Ja作用后ACC-2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化結(jié)果:空白對照組:ACC-2細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞呈梭形、多邊形，異

7、型性明顯。5-Fu組和Me-Ja組及聯(lián)合作用組均可見部分細(xì)胞脫落，貼壁細(xì)胞明顯減少。Me-Ja+5-Fu組脫落細(xì)胞更多，貼壁細(xì)胞數(shù)目較單藥作用組更少。
　　4.CCK-8法檢測各組ACC-2細(xì)胞增殖抑制率結(jié)果:5-Fu組為44.22％，Me-Ja組為44.92％，Me-Ja+5-Fu組為49.30％。5-Fu與Me-Ja單獨作用組之間相比，P＞0.05，聯(lián)合作用組與單藥作用組相比P＜0.05，說明5-Fu與Me-Ja單獨作用對AC

8、C-2細(xì)胞的增值抑制率無明顯差別，聯(lián)合用藥效果優(yōu)于單獨用藥。
　　5.透射電鏡下觀察各組ACC-2細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)結(jié)果:空白對照組ACC-2細(xì)胞幼稚，分化程度低，增殖力強(qiáng)，屬惡性腫瘤細(xì)胞的典型特征。5-Fu組和Me-Ja組及聯(lián)合作用組均可見到部分細(xì)胞表面微絨毛消失，細(xì)胞之間連接變少甚至消失，部分細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡改變，聯(lián)合作用組尤其明顯。
　　6.流式細(xì)胞術(shù)檢測各組ACC-2細(xì)胞周期分布結(jié)果:空白對照組:ACC-2細(xì)胞有40.8％處于

9、G1期，有24.6％處于S期;5-Fu組:有55.9％的細(xì)胞處于G1期;17.2％的細(xì)胞處于S期;細(xì)胞阻滯于G1期;Me-Ja組:62.1％的細(xì)胞處于G1期，17.3％的細(xì)胞處于S期，細(xì)胞也阻滯于G1期;亞二倍體峰出現(xiàn)，說明部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。Me-Ja+5-Fu組:61.2％的細(xì)胞處于G1期，僅7.1％的細(xì)胞處于S期，細(xì)胞G1期阻滯效果更明顯，典型凋亡亞二倍體峰可見，更多細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。
　　7.RT-PCR法檢測各組ACC-2細(xì)胞

10、Bcl-2和BaxmRNA表達(dá)結(jié)果:Me-Ja、5-Fu和Me-Ja+5-Fu分別作用48h后，ACC-2細(xì)胞內(nèi)Bcl-2mRNA的表達(dá)水平相對空白對照組均明顯下降（P＜0.05)，而BaxmRNA的表達(dá)水平相對空白對照組明顯升高（P＜0.05）。
　　8.免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測Bcl-2和Bax蛋白結(jié)果:Me-Ja、5-Fu和Me-Ja+5-Fu分別作用48h后，各實驗組ACC-2細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白在胞漿中表達(dá)水平均明顯低于對