新城疫病毒HN和F蛋白的表達(dá)及對(duì)肝癌細(xì)胞多核融合作用的研究.pdf

1、新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）是不分段的、單股負(fù)鏈RNA病毒，屬副粘病毒科腮腺炎病毒屬。NDV 具有天然的在人腫瘤細(xì)胞選擇性復(fù)制的特點(diǎn)，由于對(duì)人類(lèi)無(wú)致病原性，近年來(lái)在腫瘤治療方面的應(yīng)用得到關(guān)注。 目前NDV 用于腫瘤治療主要集中在兩個(gè)方面：1）在臨床上用弱毒株NDV感染患者自體腫瘤細(xì)胞制成瘤苗，對(duì)患者進(jìn)行術(shù)后主動(dòng)免疫治療。2）利用強(qiáng)毒株NDV 直接進(jìn)行腫瘤的病毒治療以及將其作為載體攜帶外源基

2、因用于基因治療。 NDV 的RNA 基因組全長(zhǎng)約15kb，包含6 個(gè)基因，其中編碼的血凝素-神經(jīng)氨酸酶（hemagglutinin-neuraminidase, HN）和融合蛋白（fusion protein，F(xiàn)）表達(dá)在病毒的包膜上。HN 蛋白的功能體現(xiàn)在三個(gè)方面：①受體識(shí)別：識(shí)別宿主細(xì)胞表面含唾液酸的糖蛋白受體，介導(dǎo)病毒顆粒吸附于靶細(xì)胞膜上，從而啟動(dòng)感染過(guò)程；②神經(jīng)氨酸酶活性：能水解宿主細(xì)胞內(nèi)新合成糖蛋白上的唾液酸，因此在病毒

3、復(fù)制周期中能抑制新合成病毒顆粒的聚集以及促進(jìn)新合成病毒粒子從感染的細(xì)胞中釋放。③促膜融合：和F 蛋白相互作用，激活F 蛋白的促膜融合作用，最終NDV 膜和靶細(xì)胞膜相互融合，導(dǎo)致病毒進(jìn)入胞漿復(fù)制。F 蛋白除了促膜融合作用外，其氨基酸序列對(duì)病毒毒力也有很大影響。 基于HN 和F 蛋白相互作用具有促進(jìn)細(xì)胞膜融合的作用，本課題研究的主要目的是：通過(guò)表達(dá)NDV Italien 株的HN 和F 蛋白，研究他們各自的功能及相互作用，進(jìn)一步研究

4、HN 和F 蛋白共表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞的促膜融合作用，為肝癌的治療提供新思路。 本課題共分三個(gè)部分：①構(gòu)建NDV Italien 株的HN 基因的真核表達(dá)載體，通過(guò)western blot、免疫熒光技術(shù)鑒定HN 蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步檢測(cè)HN蛋白的促紅細(xì)胞凝集功能和神經(jīng)氨酸酶活性。②構(gòu)建NDV Italien 株的F 基因的真核表達(dá)載體，通過(guò)免疫熒光技術(shù)鑒定F 蛋白的表達(dá)，通過(guò)將HN 和F真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染COS-7 細(xì)胞，用蘇木精染色法

5、檢測(cè)F 蛋白的促膜融合作用。③通過(guò)將HN 和F 真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HHCC 細(xì)胞，用蘇木精染色法檢測(cè)HN 和F 蛋白相互作用對(duì)肝癌細(xì)胞HHCC 的多核融合作用。 我們首先通過(guò)RT-PCR 的方法克隆了NDV Italien 株的HN 和F 基因，并各自分別引入了EcoR V 和Xbal I 兩個(gè)酶切位點(diǎn)，連接T 載體、測(cè)序。然后通過(guò)分別雙酶切HN、F 基因和真核表達(dá)載體pcDNA3.1，將HN、F 基因連入到pcDNA3.1 載

6、體中，通過(guò)PCR 和酶切鑒定證明，HN 和F 基因正確地連入到pcDNA3.1 載體中，分別命名為pcDNA3.1-HN 和pcDNA3.1-F。將構(gòu)建的兩個(gè)真核質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染COS-7 細(xì)胞，western blot、免疫熒光顯微鏡技術(shù)證明HN 和F 蛋白都在COS-7 細(xì)胞中得到了瞬時(shí)表達(dá)。功能試驗(yàn)結(jié)果表明，HN蛋白具有促紅細(xì)胞凝集和神經(jīng)氨酸酶的功能，HN 和F 蛋白相互作用具有促膜融合的功能。進(jìn)一步將HN和F共轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HHCC，