三氧化二砷抑制GLI1表達誘導肝癌干細胞分化延長術后生存期的實驗研究.pdf

1、目的：
　　肝細胞癌（簡稱肝癌）位于全球男性常見腫瘤發(fā)病率的第五位，死亡原因的第二位，在女性當中，位于常見腫瘤發(fā)病率的第七位及死亡原因的第六位。目前，手術治療仍是肝癌的首選治療方法，但因為缺少有效的輔助治療使肝癌的術后復發(fā)率仍然較高，長期預后仍不滿意。肝癌干細胞在肝癌術后復發(fā)中起著關鍵作用。CD133+肝癌細胞因較強的成瘤能力，自我更新及對放療的抵抗性而被認為具有肝癌干細胞的特性。干細胞的誘導分化治療可以使干細胞向非干細胞分化，失

2、去其自我更新能力從而可以使其惡性潛能得到控制。三氧化二砷可以誘導急性早幼粒細胞白血病細胞分化及凋亡使患者緩解率大幅上升，生存期明顯延長。在本研究中，我們假設三氧化二砷是否可以誘導肝癌干細胞分化，抑制術后復發(fā)及延長生存期，并探索其作用機制。
　　方法：
　　本研究設計如下:
　　1、體外試驗
　　選用人肝癌細胞株Huh7及Hep3B，利用流式細胞儀技術篩選出CD133+的Huh7及Hep3B細胞，陽性率超過90％進

3、行體外試驗。我們研究了三氧化二砷對其干預后，利用RT-PCR技術觀察了CD133 mRNA的變化、利用Western blotting及免疫熒光技術觀察了CD133蛋白的改變、利用流式細胞儀技術觀察了CD133+細胞的比例變化、利用體外成球試驗觀察了肝癌干細胞的自我更新能力的改變、利用NOD/SCID小鼠皮下成瘤觀察了其體內成瘤能力的改變、利用基因芯片觀察了其干性基因的變化、利用CCK8觀察了三氧化二砷對其增殖的影響。
　　2、體

4、內試驗
　　裸鼠原位接種Huh7/Huh7-GFP(熒光蛋白穩(wěn)轉細胞株)及Hep3B/Hep3B-GFP(熒光蛋白穩(wěn)轉細胞株)細胞，2周后行根治性切除，切除后給予每天1.5mg/kg三氧化二砷腹腔注射治療，觀察了裸鼠的復發(fā)及生存期，并觀察三氧化二砷對循環(huán)血腫瘤細胞(CTCs)的影響。
　　3、機制探索
　　我們進一步利用基因芯片技術探索了三氧化二砷誘導肝癌干細胞分化的調控機制，并構建慢病毒干擾/過表達目的基因的穩(wěn)定細胞

5、株，進行驗證。
　　結果：
　　三氧化二砷體外可以誘導CD133+肝癌干細胞分化，表現為下調CD133mRNA、蛋白的表達及干性基因的表達，并且能夠抑制干細胞的自我更新能力及成瘤能力，并且不抑制其增殖。在體內試驗中，三氧化二砷可以使裸鼠的術后復發(fā)率明顯下降:Huh7-GFP細胞株復發(fā)率由75％下降為33.33％(P=0.0405)，Hep3B-GFP細胞株由91.67％下降為41.67％(P=0.0094);生存期明顯延長:

6、Huh7細胞株中位生存時間由72.5天延長至86.5天(P=0.0344)，Hep3B細胞株由89.5天延長至104天(P=0.015);三氧化二砷能夠明顯降低循環(huán)血腫瘤細胞:Huh7-GFP細胞株循環(huán)血腫瘤與全血單核細胞(PBMC)的比例由1.758％下降至1.292％（P=0.0305），Hep3B-GFP細胞株由1.235％下降至0.619％(P＜0.0001)，體內試驗同時表明三氧化二砷對實驗動物沒有明顯的毒副作用。三氧化二砷可

7、以明顯抑制Hedgehog-GLI通路中GLI1及其下游基因的表達，通過構建GLI1過表達和干擾的細胞穩(wěn)定株，發(fā)現CD133相應的發(fā)生過表達或抑制，同時三氧化二砷并不能明顯降低GLI1干擾細胞CD133表達。
　　結論:
　　1、三氧化二砷可以誘導肝癌干細胞分化;
　　2、三氧化二砷可以抑制肝癌術后復發(fā)，延長生存期，并能降低循環(huán)血腫瘤細胞;
　　3、三氧化二砷誘導肝癌干細胞分化的作用機制可能在于抑制GLI1的表達

8、。
　　應用價值：
　　1、細胞實驗及動物實驗提示三氧化二砷可以誘導肝癌干細胞分化，抑制術后復發(fā)，延長生存期，為臨床應用提供充足的實驗基礎;
　　2、三氧化二砷可以通過抑制GLI1的表達達到誘導肝癌干細胞分化，抑制復發(fā)，延長生存期的作用，為臨床挑選適合三氧化二砷治療的病人提供理論基礎。
　　創(chuàng)新點
　　1、首先提出三氧化二砷可以誘導肝癌干細胞分化;
　　2、發(fā)現三氧化二砷誘導肝癌干細胞分化的機制可能在