三氧化二砷抑制GLI1表達(dá)誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞分化延長術(shù)后生存期的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　肝細(xì)胞癌（簡稱肝癌）位于全球男性常見腫瘤發(fā)病率的第五位，死亡原因的第二位，在女性當(dāng)中，位于常見腫瘤發(fā)病率的第七位及死亡原因的第六位。目前，手術(shù)治療仍是肝癌的首選治療方法，但因?yàn)槿鄙儆行У妮o助治療使肝癌的術(shù)后復(fù)發(fā)率仍然較高，長期預(yù)后仍不滿意。肝癌干細(xì)胞在肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)中起著關(guān)鍵作用。CD133+肝癌細(xì)胞因較強(qiáng)的成瘤能力，自我更新及對放療的抵抗性而被認(rèn)為具有肝癌干細(xì)胞的特性。干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化治療可以使干細(xì)胞向非干細(xì)胞分化，失

2、去其自我更新能力從而可以使其惡性潛能得到控制。三氧化二砷可以誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞分化及凋亡使患者緩解率大幅上升，生存期明顯延長。在本研究中，我們假設(shè)三氧化二砷是否可以誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞分化，抑制術(shù)后復(fù)發(fā)及延長生存期，并探索其作用機(jī)制。
　　方法：
　　本研究設(shè)計如下:
　　1、體外試驗(yàn)
　　選用人肝癌細(xì)胞株Huh7及Hep3B，利用流式細(xì)胞儀技術(shù)篩選出CD133+的Huh7及Hep3B細(xì)胞，陽性率超過90％進(jìn)

3、行體外試驗(yàn)。我們研究了三氧化二砷對其干預(yù)后，利用RT-PCR技術(shù)觀察了CD133 mRNA的變化、利用Western blotting及免疫熒光技術(shù)觀察了CD133蛋白的改變、利用流式細(xì)胞儀技術(shù)觀察了CD133+細(xì)胞的比例變化、利用體外成球試驗(yàn)觀察了肝癌干細(xì)胞的自我更新能力的改變、利用NOD/SCID小鼠皮下成瘤觀察了其體內(nèi)成瘤能力的改變、利用基因芯片觀察了其干性基因的變化、利用CCK8觀察了三氧化二砷對其增殖的影響。
　　2、體

4、內(nèi)試驗(yàn)
　　裸鼠原位接種Huh7/Huh7-GFP(熒光蛋白穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株)及Hep3B/Hep3B-GFP(熒光蛋白穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株)細(xì)胞，2周后行根治性切除，切除后給予每天1.5mg/kg三氧化二砷腹腔注射治療，觀察了裸鼠的復(fù)發(fā)及生存期，并觀察三氧化二砷對循環(huán)血腫瘤細(xì)胞(CTCs)的影響。
　　3、機(jī)制探索
　　我們進(jìn)一步利用基因芯片技術(shù)探索了三氧化二砷誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制，并構(gòu)建慢病毒干擾/過表達(dá)目的基因的穩(wěn)定細(xì)胞

5、株，進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　　三氧化二砷體外可以誘導(dǎo)CD133+肝癌干細(xì)胞分化，表現(xiàn)為下調(diào)CD133mRNA、蛋白的表達(dá)及干性基因的表達(dá)，并且能夠抑制干細(xì)胞的自我更新能力及成瘤能力，并且不抑制其增殖。在體內(nèi)試驗(yàn)中，三氧化二砷可以使裸鼠的術(shù)后復(fù)發(fā)率明顯下降:Huh7-GFP細(xì)胞株復(fù)發(fā)率由75％下降為33.33％(P=0.0405)，Hep3B-GFP細(xì)胞株由91.67％下降為41.67％(P=0.0094);生存期明顯延長:

6、Huh7細(xì)胞株中位生存時間由72.5天延長至86.5天(P=0.0344)，Hep3B細(xì)胞株由89.5天延長至104天(P=0.015);三氧化二砷能夠明顯降低循環(huán)血腫瘤細(xì)胞:Huh7-GFP細(xì)胞株循環(huán)血腫瘤與全血單核細(xì)胞(PBMC)的比例由1.758％下降至1.292％（P=0.0305），Hep3B-GFP細(xì)胞株由1.235％下降至0.619％(P＜0.0001)，體內(nèi)試驗(yàn)同時表明三氧化二砷對實(shí)驗(yàn)動物沒有明顯的毒副作用。三氧化二砷可

7、以明顯抑制Hedgehog-GLI通路中GLI1及其下游基因的表達(dá)，通過構(gòu)建GLI1過表達(dá)和干擾的細(xì)胞穩(wěn)定株，發(fā)現(xiàn)CD133相應(yīng)的發(fā)生過表達(dá)或抑制，同時三氧化二砷并不能明顯降低GLI1干擾細(xì)胞CD133表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1、三氧化二砷可以誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞分化;
　　2、三氧化二砷可以抑制肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)，延長生存期，并能降低循環(huán)血腫瘤細(xì)胞;
　　3、三氧化二砷誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞分化的作用機(jī)制可能在于抑制GLI1的表達(dá)

8、。
　　應(yīng)用價值：
　　1、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動物實(shí)驗(yàn)提示三氧化二砷可以誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞分化，抑制術(shù)后復(fù)發(fā)，延長生存期，為臨床應(yīng)用提供充足的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ);
　　2、三氧化二砷可以通過抑制GLI1的表達(dá)達(dá)到誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞分化，抑制復(fù)發(fā)，延長生存期的作用，為臨床挑選適合三氧化二砷治療的病人提供理論基礎(chǔ)。
　　創(chuàng)新點(diǎn)
　　1、首先提出三氧化二砷可以誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞分化;
　　2、發(fā)現(xiàn)三氧化二砷誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞分化的機(jī)制可能在