丹參酮ⅡA通過促血管正?；种聘伟┕孟⑿郧谐g(shù)后轉(zhuǎn)移增強及延長生存期.pdf

1、原發(fā)性肝癌(主要指肝細胞癌，簡稱肝癌)是世界第三位、我國第二位癌癥死亡原因。手術(shù)切除仍是早期肝癌的首選治療策略，然而由于肝癌的多灶性及早期血管侵犯等特性，術(shù)后5年的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移風(fēng)險仍然高達70％。盡管針對復(fù)發(fā)瘤可二次切除，但大多數(shù)患者已無手術(shù)機會。對于遠處轉(zhuǎn)移的患者，常規(guī)治療手段大都無效。復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移已成為肝癌患者的主要死因，即使早期肝癌也可有較高轉(zhuǎn)移潛能，腫瘤生長與轉(zhuǎn)移可同時進行。
　　 由于影像學(xué)未能發(fā)現(xiàn)的微衛(wèi)星灶及微血管侵犯的存

2、在，大部分肝癌“根治性切除”手術(shù)實質(zhì)上屬于姑息性切除。原發(fā)瘤一旦被切除，殘余癌細胞及術(shù)前已播散的異位癌細胞可能獲得或增強轉(zhuǎn)移潛能，形成復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移灶或轉(zhuǎn)移至新的組織器官。姑息性手術(shù)所造成的系列影響可能是術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的主要原因。因此研究姑息性切除對殘余肝癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響及其干預(yù)具有重要臨床意義。
　　 姑息性切除術(shù)后血管旺生，但往往幼稚且結(jié)構(gòu)不完整，造成殘癌缺氧加重。一方面缺氧的殘癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移潛能增強，另一方面結(jié)構(gòu)異常的新生血

3、管更有利于殘癌細胞侵出血管及在轉(zhuǎn)移靶器官定植，最終導(dǎo)致復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。因此，具潛在促血管正?；乃幬锟赡芤种颇[瘤轉(zhuǎn)移。
　　 丹參酮Ⅱ A是從中藥丹參提取的活性單體成分，常用于心腦血管疾病患者，亦常用于肝炎患者，具有活血化瘀、改善微循環(huán)的作用。我組既往研究發(fā)現(xiàn)含丹參的五味中藥“松友飲”可抑制姑息性切除術(shù)后肝癌轉(zhuǎn)移，然其機制未明。我們認為其活血化瘀作用可能包含促血管正?；饔?。
　　 本課題首先選用高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌MHCC97H

4、細胞系，建立單肝葉雙瘤原接種的肝癌姑息性切除術(shù)后裸鼠殘癌模型。再應(yīng)用高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌HCCLM3和低轉(zhuǎn)移潛能HepG2裸鼠模型，驗證術(shù)后殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能變化，結(jié)果表明肝癌姑息性切除術(shù)后殘癌生長和轉(zhuǎn)移顯著增強。隨之我們將丹參酮Ⅱ A直接用于單瘤原原位接種模型，發(fā)現(xiàn)它不能抑制移植瘤生長但可減少轉(zhuǎn)移、顯著延長荷瘤裸鼠生存期。在此基礎(chǔ)上，我們進一步將它用于殘癌模型，觀察它對殘癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響及主要作用機制。最后結(jié)合臨床實際，我們將丹參酮ⅠA與干

5、擾素α聯(lián)用，觀察它是否能減低后者的給藥劑量及縮短其給藥時間。
　　 1.肝癌姑息性切除術(shù)后裸鼠殘癌模型的建立
　　 采用單肝葉雙瘤原原位接種技術(shù)建立MHCC97H裸鼠原位移植瘤模型，行姑息性切除術(shù)(PR)切除1瘤，觀察5周。結(jié)果表明雙瘤模型的雙瘤成瘤率95.6％、PR成功率95.3％(手術(shù)死亡率4.7％)、裸鼠總體存活率90.2％，與單瘤原接種后行PR比較具有顯著優(yōu)勢，后者的成瘤率100％、手術(shù)死亡率73.3％、總體存活

6、率20％。成功建立姑息性切除術(shù)后的裸鼠殘癌模型。
　　 2.肝癌姑息性切除術(shù)后殘癌轉(zhuǎn)移顯著增強
　　 姑息性切除術(shù)(PR)組的平均腫瘤體積大于假手術(shù)(Sham)組(P<0.05)。與Sham組比較，PR組的肺轉(zhuǎn)移(僅HCCLM3)顯著增加(110.11±28.01vs7.22±4.71，P<0.001)、肝內(nèi)播散和腹腔轉(zhuǎn)移亦顯著增加(P<0.05)，術(shù)后2天和35天的循環(huán)血腫瘤細胞比例也均顯著增加(P<0.001)。

7、r>　　 3.丹參酮ⅡA不能直接抑制移植瘤生長，但可減少轉(zhuǎn)移，延長荷瘤裸鼠生存期
　　 在單瘤給藥模型，生理鹽水、TanⅡA1，5，10 mg/kg/day四組的腫瘤大小無差別。與生理鹽水組比較，TanⅡA5和10 mg/kg/day組的肺轉(zhuǎn)移顯著減少(P=0.046和P<0.001)、肝內(nèi)播散率和腹腔轉(zhuǎn)移也顯著降低(P<0.05)、生存期(見下)顯著延長(P<0.05)。分別與TanⅡA1和5 mg/kg/day組比較，10

8、 mg/kg/day組的肺轉(zhuǎn)移也顯著減少(P=0.003和P=0.046)。HepG2未發(fā)現(xiàn)腹腔轉(zhuǎn)移。TanⅡA10 mg/kg/day的抑制效果最強，因而被選用于后續(xù)實驗。
　　 4.丹參酮ⅡA顯著抑制肝癌姑息性切除術(shù)后殘癌轉(zhuǎn)移，延長裸鼠生存期
　　 PR后TanⅡA10 mg/kg/day給藥組殘癌體積較給生理鹽水組縮小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與PR后給生理鹽水組比較，TanⅡA給藥組肺轉(zhuǎn)移(僅HCCLM

9、3)顯著減少(13.56±11.33 vs94.56±31.47，P<0.001)、肝內(nèi)播散和腹腔轉(zhuǎn)移亦減少(P<0.01)、循環(huán)血腫瘤細胞比例(以腫瘤體積標(biāo)準(zhǔn)化后)則相對降低(P<0.001)。最重要的是，給藥過程中發(fā)現(xiàn)TanⅡA可顯著延遲荷殘癌裸鼠體重的下降；前述發(fā)現(xiàn)PR組裸鼠生存期顯著短于Sham組(P<0.01)；在單瘤給藥模型，TanⅡA較生理鹽水組可顯著延長荷瘤裸鼠生存期HCCLM3高達16天(P=0.004)及HepG2高

10、達19天(P<0.001)；在雙瘤給藥模型，TanⅡA還可使PR后縮短的生存期再顯著延長(HCCLM3:47.833±3.280 vs69.000±1.693；HepG2:52.167±2.496 vs79.667±2.940，均P=0.001)。
　　 5.丹參酮ⅡA不能抑制肝癌細胞增殖，但可降低其侵襲運動能力
　　 與0.1％DMSO(TanⅡA溶劑)對照組比較，TanⅡA0.01-100μmol/L(μM)各梯度濃

11、度組的光吸收值(OD值，代表細胞增殖密度)均無顯著變化；TanⅡA5和10μM組侵襲的細胞數(shù)均顯著減少(均P<0.01)，而TanⅡA1μM組不減少，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 6.丹參酮ⅡA顯著改善殘癌缺氧，卻并不能下調(diào)體外肝癌細胞缺氧模型的HIF-1α表達
　　 PR后殘癌Pimonidazole和HIF-1α均顯著增加，與該變化一致，殘癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)顯著增強(N-cadherin和Vimentin上調(diào)，E

12、-cadherin下調(diào))；PR后給予TanⅡA使兩者均降低，同時殘癌EMT被逆轉(zhuǎn)；表明PR顯著促進殘癌缺氧并誘導(dǎo)殘癌細胞EMT變化，TanⅡA在體給藥可減輕殘癌缺氧同時抑制EMT。體外肝癌細胞低氧培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)HIF-1α、N-cadherin、Vimentin均上調(diào)、E-cadherin下調(diào)，然而加入TanⅡA干預(yù)發(fā)現(xiàn)，除E-cadherin被上調(diào)外，其余3個分子并未如預(yù)期結(jié)果被下調(diào)。進一步檢測發(fā)現(xiàn)TanⅡA確可直接上調(diào)腫瘤細胞E-cadh

13、erin。整個實驗中各分子的mRNA和蛋白表達變化基本一致。
　　 7.丹參酮ⅡA不改變殘癌微血管密度(MVD)，但顯著增加微血管完整度(MVI)
　　 鼠MVD以CD31為標(biāo)記，NG2是血管周細胞的主要分子標(biāo)記，在本研究用于評估MVI。PR組平均CD31密度高于Sham組(P<0.001)，而PR后給TanⅡA和生理鹽水兩組間CD31無差異。與Sham組比較，PR后NG2表達無改變，而PR后給TanⅡA組NG2水平顯著

14、升高(P<0.01)。連續(xù)切片免疫組化CD31、NG2、Pimonidazole染色發(fā)現(xiàn)，PR后給生理鹽水組殘癌CD31高、NG2低、缺氧嚴(yán)重(Pimonidazole染色面積大)；而PR后給TanⅡA組CD31高、NG2也高、因而缺氧較輕；表明PR后殘癌MVD增加、但MVI卻較低下，TanⅡA雖不能抑制MVD(血管生成)、但顯著增加MVI促進腫瘤血管完整。腫瘤血管掃描電鏡可直接觀察到TanⅡA組血管壁完整性明顯高于生理鹽水組。免疫熒光

15、雙標(biāo)結(jié)果進一步證實TanⅡA不改變CD31、但上調(diào)NG2，因而降低殘癌缺氧。
　　 8.丹參酮ⅡA顯著增強內(nèi)皮細胞(HUVECs、人和鼠TECs)體外成管能力，與上調(diào)VEGFR1和PDGFR表達密切相關(guān)
　　 體外常氧和低氧培養(yǎng)的HUVECs和人TECs的成管能力在加TanⅡA干預(yù)時均顯著增強。從PR后TanⅡA(in vivo)給藥組分選的TECs，其成管能力明顯強于從PR組分選的TECs。應(yīng)用PR組TECs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)

16、其成管能力亦可被體外加TanⅡA(in vitro)干預(yù)顯著增強，且與TanⅡA(in vivo)給藥組大致相當(dāng)。流式細胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)TanⅡA(in vivo)給藥組TECs表面VEGFR1和PDGFR表達陽性細胞比例以及兩者的相對熒光強度均顯著高于PR(生理鹽水)組(P<0.05)，而兩組間VEGFR2、EGFR、FGFR1均無差異。應(yīng)用VEGFR1/PDGFR選擇性抑制劑SU6668，結(jié)果進一步表明，TanⅡA體內(nèi)外干預(yù)增強TECs

17、成管的能力被顯著削弱，而在無TanⅡA干預(yù)時SU6668的抑成管作用并不明顯。
　　 9.丹參酮ⅡA與干擾素α聯(lián)用，可使后者給藥劑量減少三分之一
　　 基于TanⅡA的上述發(fā)現(xiàn)，我們繼續(xù)比較PR后應(yīng)用大劑量IFN-α(1.5×107U/kg/day)與聯(lián)用IFN-α劑量減低三分之一(1.0×107 U/kg)隔日給藥加TanⅡA(10 mg/kg/day)兩種給藥方式間療效的差別。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IFN-α單用組和聯(lián)用組的平均

18、腫瘤體積分別為0.391±0.411 cm3和0.756±0.349 cm3，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.282)，且均小于生理鹽水組的3.160±0.405 cm3(P<0.001)；IFN-α單用組和聯(lián)用組的平均肺轉(zhuǎn)移灶個數(shù)分別為12.83±6.85和1.50±2.51，聯(lián)用組少于單用組(P=0.001)，且均少于生理鹽水組的29.33±6.95(P<0.001)；表明兩組間抑瘤效果無差異，IFN-α劑量減低三分之一隔日給藥與T

19、anⅡA聯(lián)用抑轉(zhuǎn)移作用強于大劑量IFN-α單用。
　　 結(jié)論：
　　 1.丹參酮Ⅱ A通過促進VEGFR1/PDGFR上調(diào)相關(guān)的腫瘤血管正?；种聘伟┕孟⑿郧谐g(shù)后殘癌轉(zhuǎn)移的增強，并延長荷殘癌裸鼠生存期。
　　 2.丹參酮Ⅱ A與干擾素α聯(lián)用，可使后者給藥劑量減低三分之一，而達大劑量干擾素α相當(dāng)?shù)寞熜А?br>　　 創(chuàng)新點：
　　 1.首次發(fā)現(xiàn)丹參酮Ⅱ A可顯著抑制肝癌姑息性切除術(shù)后殘癌轉(zhuǎn)移的增強、并延

20、長生存期，其機制主要通過促進VEGFR1/PDGFR上調(diào)相關(guān)的腫瘤血管正?；瘉韺崿F(xiàn)。
　　 2.創(chuàng)建單肝葉雙瘤原的原位接種再行姑息性切除術(shù)的裸鼠殘癌模型。
　　 臨床應(yīng)用前景和科學(xué)意義：
　　 1.本實驗發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA通過“血管正?；币种聘伟┣谐筠D(zhuǎn)移并延長生存期，將為臨床提供簡單易行副反應(yīng)小的預(yù)防轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的輔助療法，并可減少干擾素用量使病人耐受較長期用藥。
　　 2.本研究提示通過血管正常化的“疏導(dǎo)”