MSCs多向分化潛能及對(duì)失神經(jīng)肌萎縮的作用.pdf

1、第一部分
　　 目的：①探討間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)體外誘導(dǎo)分化為骨樣細(xì)胞、肌樣細(xì)胞以及神經(jīng)元(NCs)樣/星形膠質(zhì)樣細(xì)胞的有效方法。②評(píng)價(jià)體外誘導(dǎo)分化的神經(jīng)前體樣細(xì)胞(NPCs)、神經(jīng)元(NCs)樣細(xì)胞以及星形膠質(zhì)樣細(xì)胞的體外存活和增殖特性，為神經(jīng)細(xì)胞再生尋找良好的種子來(lái)源。
　　 方法：參考有關(guān)文獻(xiàn)，采用貼壁篩選法自大鼠骨髓中分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行傳代純化，收集得到第5 代(P5)間充質(zhì)干細(xì)胞單細(xì)胞懸液(1×10

2、5～6/ml)。①成骨誘導(dǎo)分化方案：DMEM/10[％]FBS 培養(yǎng)基＋0.1 μmol/l 地塞米松＋50ng/ml 維生素C+2.16mg/ml β-甘油磷酸鈉。誘導(dǎo)分化2周以上。行Van Kossa 銀染色和茜素紅染色。②成肌誘導(dǎo)分化方案：DMEM/20[％]FB S+3 μmol/l5-氮胞苷(5-azayttidine)。誘導(dǎo)分化24h，培養(yǎng)2～3周以上。觀察形成的肌樣細(xì)胞及肌管樣結(jié)構(gòu)。③神經(jīng)定向誘導(dǎo)分化方案：采用多因子、分階

3、段逐步誘導(dǎo)方法定向誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)前體細(xì)胞(NPCs)，進(jìn)而分化為NCs樣/星形膠質(zhì)樣細(xì)胞。即：MSCs 以1×10 6 /L 置入6 孔培養(yǎng)板中，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基：DMEM/20[％]FBS 培養(yǎng)基，24h 后更換為誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基：DMEM/F12+2％B27+40μg/L 堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)+20μg/L 表皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(EGF)，培養(yǎng)10～20d，定向誘導(dǎo)MSCs分化為NPCs。下一個(gè)階段更換誘導(dǎo)分化培

4、養(yǎng)基為生長(zhǎng)培養(yǎng)基：DMEM/5[％]FBS，分兩組進(jìn)行誘導(dǎo)：一組向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化：全反式維甲酸(RA)連續(xù)加樣，首次濃度0.5μmol/L，以后每天半量加樣；二組向星形膠質(zhì)樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化：10μg/L 血小板衍生生長(zhǎng)因子BB (PDGF-BB)首次加樣，以后每天半量加樣，均連續(xù)誘導(dǎo)10～14d，制作兩組細(xì)胞爬片均行纖維絲蛋白200(NF200)、膠質(zhì)纖維酸性陽(yáng)性蛋白(GFAP)免疫組織化學(xué)熒光染色。④神經(jīng)元樣/星形膠質(zhì)樣細(xì)胞共同培

5、養(yǎng)：收集誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元樣/星形膠質(zhì)樣細(xì)胞，各自濃度1×106 /L，以1:1 混合在DMEM/5[％]FBS 培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)。觀察兩組細(xì)胞生長(zhǎng)情況。⑤應(yīng)用活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK-8檢測(cè)單獨(dú)誘導(dǎo)分化的NCs樣/星形膠質(zhì)樣細(xì)胞的增殖及存活情況，繪制生長(zhǎng)曲線及細(xì)胞存活曲線。
　　 結(jié)果：①經(jīng)DMEM/10[％]FBS 培養(yǎng)基＋0.1 μmol/l地塞米松＋50ng/ml 維生素C+2.16mg/ml β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)培養(yǎng)2周以上

6、，MSCs 細(xì)胞聚集呈結(jié)節(jié)狀，鈣鹽沉積，Van Kossa 銀染色法陽(yáng)性。茜素紅染色陽(yáng)性。②經(jīng)3 μmol/l 5-氮胞苷誘導(dǎo)處理大鼠MSCs，24小時(shí)部分細(xì)胞胞體收縮變?yōu)槭蓍L(zhǎng)形狀，1～2周后細(xì)胞相互形成肌管樣結(jié)構(gòu)。2周后可以觀察到自發(fā)搏動(dòng)。③bFGF+EGF 連續(xù)誘導(dǎo)7d 后MSCs分化為球團(tuán)樣的神經(jīng)前體樣細(xì)胞，巢蛋白(Nestin)表達(dá)陽(yáng)性。RA、PDGF-BB分別連續(xù)誘導(dǎo)10d 后MSCs逐步分化出神經(jīng)元樣、星形膠質(zhì)樣細(xì)胞，分別表

7、達(dá)NF200、GFAP蛋白。④神經(jīng)元樣/星形膠質(zhì)樣細(xì)胞可以共同培養(yǎng)、生長(zhǎng)，呈現(xiàn)各自的細(xì)胞形態(tài)。⑤活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK-8檢測(cè)顯示：神經(jīng)元樣細(xì)胞早期生長(zhǎng)較緩慢，具有一定的增殖能力，6～7d 后達(dá)到高峰，此后增殖能力明顯下降，細(xì)胞存活率明顯下降，14～15d 之后細(xì)胞存活率下降到7.6[％]以下，難以傳代培養(yǎng)。星形膠質(zhì)樣細(xì)胞初期生長(zhǎng)慢，5d 后生長(zhǎng)加速，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，7～8d 后進(jìn)入平臺(tái)期,仍保持較高的細(xì)胞存活率。
　　 結(jié)論：

8、①M(fèi)SCs是具有自我增殖和多向分化潛能的干細(xì)胞?？梢哉T導(dǎo)分化為骨樣細(xì)胞、骨骼肌樣細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞及星形膠質(zhì)樣細(xì)胞。②誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元樣/星形膠質(zhì)樣細(xì)胞可以共同培養(yǎng)、生長(zhǎng)。③單獨(dú)誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞可繼續(xù)存活13-15d 后發(fā)生自然死亡，難以傳代，星形膠質(zhì)樣細(xì)胞生長(zhǎng)較穩(wěn)定，具有較強(qiáng)的存活和增殖能力，可傳代培養(yǎng)至3 代以上。
　　 第二部分
　　 目的：檢測(cè)大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)經(jīng)靜脈移植后在周?chē)窠?jīng)損傷模型內(nèi)的遷

9、移、分布情況，評(píng)價(jià)其對(duì)軸突、靶器官的保護(hù)作用。
　　 方法：制作80 只大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型，收集P5 代MSCs 行BrdU (10μmol/L)摻和標(biāo)記48 h。經(jīng)尾靜脈注射BrdU 標(biāo)記的MSCs (2×107/ml)入體內(nèi)。術(shù)后8周內(nèi)評(píng)價(jià)坐骨神經(jīng)指數(shù)(SFI)。術(shù)后神經(jīng)斷端、肌肉組織取材均行BrdU 免疫組織化學(xué)熒光染色。肌肉組織行HE 染色、TUNEL組織化學(xué)染色。Image-Pro Plus 5.0 專(zhuān)業(yè)圖像分析軟件

10、分析肌纖維橫截面積并計(jì)算以及實(shí)驗(yàn)側(cè)與正常側(cè)肌纖維橫截面積之比，分析肌細(xì)胞調(diào)亡數(shù)量。所得數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x——±s)表示，結(jié)果用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件行t檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果：MSCs體外可以被BrdU 摻和標(biāo)記，陽(yáng)性標(biāo)記率為62.5[％]。術(shù)后4、8周神經(jīng)斷端、肌肉組織內(nèi)檢測(cè)到BrdU 陽(yáng)性細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組SFI、肌纖維橫截面積明顯高于對(duì)照組，細(xì)胞凋亡數(shù)量低于對(duì)照組，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義﹙4周P＜0.05，8周P＜0.01 ﹚。
　

11、　 結(jié)論：MSCs 靜脈移植至體內(nèi)能歸巢到損傷的神經(jīng)斷端及肌肉組織，可以存活至少8周，具有促進(jìn)軸突再生、延緩肌萎縮的作用。
　　 第三部分
　　 目的：探討大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)誘導(dǎo)分化的神經(jīng)前體樣細(xì)胞(NPCs)移植在體內(nèi)存活情況，評(píng)價(jià)其及對(duì)失神經(jīng)肌萎縮的作用。
　　 方法：聯(lián)合應(yīng)用 EGF、bFGF 誘導(dǎo)MSCs分化為NPCs。行Nestin 免疫組織化學(xué)熒光染色鑒定，并行5-溴脫氧尿苷(BrdU)摻

12、和標(biāo)記實(shí)驗(yàn)和單細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)。建立90 只大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型。BrdU 摻和標(biāo)記的NPCs 以5×106/ml 注入神經(jīng)損傷斷端。術(shù)后4、8周神經(jīng)斷端、肌肉組織取材，神經(jīng)斷端分別行Nesti n、BrdU 單標(biāo)免疫熒光染色檢驗(yàn)。
　　 肌肉組織行HE 染色、TUNEL 免疫組織化學(xué)染色。Image-Pro Plus 5.0 專(zhuān)業(yè)圖像分析軟件分析肌纖維橫截面積并計(jì)算以及實(shí)驗(yàn)側(cè)與正常側(cè)肌纖維橫截面積之比。所得數(shù)據(jù)結(jié)果用SPSS 統(tǒng)計(jì)

13、軟件行t檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果：MSCs體外誘導(dǎo)分化可獲得大量活性的NPCs，Nestin蛋白染色陽(yáng)性，體外可以被BrdU 摻和標(biāo)記，陽(yáng)性標(biāo)記率為87.9[％],單細(xì)胞克窿率為2.7[％]。移植術(shù)后4、8周實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)斷端均檢測(cè)到Nesti n、BrdU 陽(yáng)性細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組肌纖維橫截面積明顯高于對(duì)照組，肌細(xì)胞調(diào)亡數(shù)量明顯低于對(duì)照組，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義﹙4周P＜0.05，8周P＜0.01﹚。
　　 結(jié)論：骨髓源性NPCs 移植至神經(jīng)斷

14、端可以存活至少8周，具有延緩失神經(jīng)肌萎縮、抑制失神經(jīng)肌肉細(xì)胞調(diào)亡的作用。
　　 第四部分
　　 目的：探討間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元(NCs)樣、星形膠質(zhì)樣細(xì)胞聯(lián)合移植后在體內(nèi)存活情況，評(píng)價(jià)其聯(lián)合移植對(duì)失神經(jīng)肌萎縮的作用。
　　 方法：多因子、分階段逐步誘導(dǎo)MSCs分化為NCs樣、星形膠質(zhì)樣細(xì)胞。行NF20 0、GFAP 免疫組織化學(xué)熒光染色鑒定。建立60 只大鼠失神經(jīng)骨骼肌模型。行細(xì)胞聯(lián)合移植，以

15、5×106/ml 肌肉注射入失神經(jīng)骨骼肌內(nèi)。術(shù)后4、8周肌肉組織取材行HE 染色、免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)NF20 0、GFAP 陽(yáng)性細(xì)胞。Image-Pro Plus 5.0 專(zhuān)業(yè)圖像分析軟件分析肌纖維橫截面積并計(jì)算以及實(shí)驗(yàn)側(cè)與正常側(cè)肌纖維橫截面積之比。所得數(shù)據(jù)結(jié)果用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件行t檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果：MSCs 逐步誘導(dǎo)分化出NCs樣、星形膠質(zhì)樣細(xì)胞。分別表達(dá)NF20 0、GFAP 陽(yáng)性蛋白。移植術(shù)后4、8周實(shí)驗(yàn)側(cè)肌肉組織檢