aFGF預(yù)防失神經(jīng)支配運動終板退變及肌萎縮的實驗研究.pdf

1、如何預(yù)防運動終板退變及肌萎縮已成為當(dāng)前臨床運動神經(jīng)損傷后功能重建過程中急需解決的難題。迄今對運動終板退變的預(yù)防研究甚少,治療方法不多。臨床常用的方法是提倡功能鍛煉,但其只能避免肌肉廢用不能提供神經(jīng)營養(yǎng)、且外科修復(fù)病例早期常需固定肢體而無法開展,作用有限。曾經(jīng)有學(xué)者提出電刺激可以替代失神經(jīng)肌肉的興奮性,并提出了實驗鼠模擬正常運動終板興奮的電刺激模式,取得了一定的效果,但電刺激作用不能持久,并有諸多不便。近年在藥物實驗研究方面取得了一些成果

2、:有作者報道大鼠腹腔注射地塞米松可以減緩減輕非離斷性神經(jīng)損傷支配運動終板的退變;口服氨哮素可以防止失神經(jīng)支配運動終板的退變,防止肌肉萎縮,其作用可能是通過某種途徑使肌衛(wèi)星細胞產(chǎn)生一種胰島素樣生長因子(IGF)的營養(yǎng)物質(zhì)模仿神經(jīng)對肌肉的營養(yǎng)作用；此外,神經(jīng)斷端間應(yīng)用神經(jīng)生長因子(NGF)及肝細胞生長因子(HGF)可減輕運動終板的退變；1996年,Margaret等報道在Ⅱ期修復(fù)神經(jīng)的同時將酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)纖維蛋白凝膠植入

3、其支配的萎縮肌腹,初步研究可以誘導(dǎo)運動終板的再生,但對不修復(fù)神經(jīng)者無明顯作用,其結(jié)果僅僅說明aFGF的作用是在修復(fù)神經(jīng)的前提下,沒有說明能否保護失神經(jīng)支配的運動終板,也沒有探討其對功能恢復(fù)效果的作用。
　　 aFGF具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng),如促進細胞增殖與分化,促進組織修復(fù),也是一種形態(tài)發(fā)生因子；其靶細胞有成肌細胞、成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞等；在重建神經(jīng)肌肉接頭時能激活靜止的未分化神經(jīng)靶細胞形成基底膜,有促進血管生成改善微循環(huán),對

4、多種組織有體內(nèi)營養(yǎng)作用。成纖維細胞有促進肌細胞基底膜形成的作用,而骨胳肌基底膜是神經(jīng)肌肉接頭形成的重要條件,因此,aFGF促進成纖維細胞的分化對神經(jīng)肌肉接頭的形成具有重要作用；很多研究表明肌肉萎縮的因為主要是肌膜受到不同程度的脂類過氧化作用,這一因素也將累及運動終板,因此,促進基底膜的形成有助于補充受損的膜性結(jié)構(gòu)。亦有研究表明aFGF能調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子的流出與流入過程,有利于促進黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)辄S嘌呤氧化酶,從而有力于自由基的清除而保

5、護膜性結(jié)構(gòu)如運動終板。此外,對成肌細胞的促進分化可以形成肌細胞并分化成肌管,有助于防止肌肉萎縮；作用于血管內(nèi)皮細胞有助于改善血循環(huán)。
　　 aFGF對運動神經(jīng)損傷后運動終板退變及肌萎縮的預(yù)防是否有作用尚無報道,本研究試圖探討aFGF對失神經(jīng)支配運動終板退變及肌萎縮的預(yù)防作用及其作用機理。
　　 研究目的:
　　 1、建立為失神經(jīng)支配運動終板及肌肉提供替代性神經(jīng)營養(yǎng)的aFGF緩釋系統(tǒng)。
　　 2、建立aFG

6、F纖維蛋白凝膠預(yù)防失神經(jīng)支配運動終板退變及肌萎縮的動物模型。
　　 3、探討aFGF纖維蛋白凝膠預(yù)防失神經(jīng)支配運動終板退變及肌萎縮的形態(tài)學(xué)及機能學(xué)效果。
　　 4、初步探討aFGF纖維蛋白凝膠預(yù)防失神經(jīng)支配運動終板退變及肌萎縮的作用機理。
　　 材料和方法:
　　 1、纖維蛋白凝膠復(fù)合aFGF緩釋系統(tǒng)的制備:
　　 2、制做動物模型及分組:155只成年純系Sprague-Dawley大鼠在全麻(1

7、0％水合氯醛腹腔注射)下切斷右側(cè)腓總神經(jīng)脛前肌分支(距神經(jīng)入肌點約1cm),隨機分為5組:修復(fù)神經(jīng)植入aFGF組(NR+aFGFgel):縫合神經(jīng)外膜+脛前肌植入aFGF纖維蛋白凝膠(aFGF25μg/只)；修復(fù)神經(jīng)植入凝膠組(NR+gel):縫合神經(jīng)外膜+脛前肌植入纖維蛋白凝膠；未修復(fù)神經(jīng)植入aFGF組(aFGFgel):脛前肌植入aFGF纖維蛋白凝膠(aFGF25μg/只)；單純修復(fù)神經(jīng)組(NR):縫合神經(jīng)外膜；未修復(fù)神經(jīng)未植入組(

8、Blank):神經(jīng)肌肉不做處理。NR+gel、NR、Blank為三個對照組。術(shù)后觀察6周。
　　 3、形態(tài)學(xué)研究:采用肉眼形態(tài)學(xué)檢查觀察肌肉的外觀形態(tài),測量脛前肌濕重,采用氯化金法染色顯示運動終板,采用超薄切片、鉛鈾染色、透射電鏡觀察運動終板超微結(jié)構(gòu),統(tǒng)計各組運動終板均數(shù)及其退變率并進行統(tǒng)計學(xué)分析。觀察aFGF纖維蛋白凝膠在體內(nèi)的降解及異常反應(yīng)。
　　 4、機能學(xué)研究:采用Karnovsky-Roots亞鐵氰化銅法顯示運

9、動終板乙酰膽堿酯酶(AchE),觀察各組運動終板AchE變化情況。
　　 5、機理研究:采用超薄切片、鉛鈾染色、透射電鏡觀察各組運動終板附近脛前肌肌衛(wèi)星細胞的形態(tài),每例隨機觀察20個超薄切片視野,統(tǒng)計肌衛(wèi)星細胞數(shù)量并進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用免疫組織化學(xué)染色檢查aFGF受體(aFGFR)表達部位；統(tǒng)計每例aFGFR陽性血管表達率；圖像分析儀測量毛細血管壁內(nèi)aFGFR平均灰度。
　　 6、試驗結(jié)果統(tǒng)計學(xué)分析:采用SPSS13.0

10、軟件包(第一軍醫(yī)大學(xué)生物統(tǒng)計學(xué)教研室)對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析(計量資料采用One-WayANOVA進行分析,多重比較采用LSD法；計數(shù)資料采用R×C表資料的x2檢驗進行分析),差異顯著性水準(zhǔn)置于0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1、肉眼形態(tài)學(xué)檢查:NR+aFGFgel組:自身對照可見兩側(cè)脛前肌對稱且無明顯肌萎縮,肌張力正常；NR+gel組及NR組表現(xiàn)相近:右側(cè)脛前肌明顯萎縮,肌張力下降；aFGFgel組:右側(cè)脛前肌略有萎縮,

11、但不如NR+gel組及NR組明顯,肌張力消失；Blank組:右側(cè)脛前肌明顯萎縮,肌張力消失。NR+aFGFgel組、NR+gel組、aFGFgel組纖維蛋白凝膠植入局部組織無異常反應(yīng)。
　　 2、脛前肌濕重:NR+aFGFgel組脛前肌濕重為1.26±0.10g,aFGFgel組脛前肌濕重為1.20±0.12g,兩組脛前肌濕重高于三個對照組,統(tǒng)計學(xué)分析有顯著性意義。
　　 3、終板染色檢查:NR+aFGFgel組可見運動

12、終板結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)正常:NR+gel組及NR組表現(xiàn)相近:失神經(jīng)肌纖維上的終板形態(tài)不規(guī)則,軸索終末分支減少而雜亂,終板呈細條狀或點狀；aFGFgel組:未見軸突,運動終板形態(tài)大致正常,但區(qū)域縮小。Blank組:未見軸突,運動終板數(shù)量明顯減少,形態(tài)不規(guī)則。
　　 4、電鏡檢查:NR+aFGFgel、aFGFgel組運動終板的數(shù)量較多,容易辨認(rèn),結(jié)構(gòu)基本正常,運動終板退變例數(shù)少。三個對照組運動終板數(shù)量減少,結(jié)構(gòu)退變,運動終板退變例數(shù)多

13、。
　　 5、神經(jīng)低頻重復(fù)電刺激檢查:NR+aFGFgel組所有大鼠神經(jīng)低頻重復(fù)電刺激時沒有出現(xiàn)大的肌電波波幅衰減反應(yīng),衰減率為5.70±3.13％,沒有出現(xiàn)陽性情況；NR+gel、NR組大鼠低頻電刺激時出現(xiàn)較大的肌電波波幅衰減反應(yīng),陽性率均為90％。NR+aFGFgel組衰減率低于對照組,統(tǒng)計學(xué)分析有顯著性意義。
　　 6、運動終板AchE活性:NR+aFGFgel、aFGFgel組運動終板染色深,顯示Ache活性強,

14、結(jié)構(gòu)接近正常,NR+aFGFgel組AchE染色面積為1693.98±168.16μm2,灰度為24.81±1.44,aFGFgel組AchE染色面積為1520.60±303.00μm2,灰度為24.93±1.54,AchE活性高于對照組,統(tǒng)計學(xué)分析有顯著性意義。
　　 7、肌衛(wèi)星細胞觀察:NR+aFGFgel、aFGFgel組肌衛(wèi)星細胞體積增大,數(shù)量多。NR+aFGFgel組MSC數(shù)量為11.00±3.00,aFGFgel組M

15、SC數(shù)量為10.40±1.14,MSC數(shù)量高于對照組,統(tǒng)計學(xué)分析有顯著意義。
　　 8、免疫組織化學(xué)檢查:aFGFR陽性部位主要定位在毛細血管壁內(nèi),NR+aFGFgel、aFGFgel組顯示毛細血管aFGFR表達密度高,毛細血管密集,對照組毛細血管aFGFR表達密度低,毛細血管稀少。
　　 結(jié)論：
　　 1、實驗證實aFGF纖維蛋白凝膠可做為失神經(jīng)支配運動終板及肌肉提供替代性神經(jīng)營養(yǎng)的藥物緩釋系統(tǒng),未見異常反應(yīng)。

16、
　　 2、聯(lián)合神經(jīng)修復(fù)及應(yīng)用aFGF纖維蛋白凝膠可明顯減輕大鼠運動神經(jīng)損傷后運動終板退變,減輕肌萎縮。
　　 3、即使神經(jīng)未及時修復(fù),應(yīng)用aFGF纖維蛋白凝膠可有效保護大鼠運動神經(jīng)損傷后所支配的運動終板、減輕肌萎縮。
　　 4、神經(jīng)重復(fù)電刺激檢查神經(jīng)肌肉間傳導(dǎo)功能表明:運動神經(jīng)損傷后聯(lián)合神經(jīng)修復(fù)及應(yīng)用aFGF纖維蛋白凝膠保護運動終板可有效改善神經(jīng)肌肉接頭間傳導(dǎo)。
　　 5、酶組織化學(xué)檢查運動終板AchE

17、活性表明:運動神經(jīng)損傷后應(yīng)用aFGF纖維蛋白凝膠保護運動終板可有效維持運動終板AchE活性,有利于神經(jīng)遞質(zhì)的正常代謝,有利于神經(jīng)沖動的正常傳遞。
　　 6、應(yīng)用aFGF纖維蛋白凝膠處理組MSC數(shù)量高于對照組,說明aFGF纖維蛋白凝膠預(yù)防運動終板退變及肌萎縮的作用與aFGF促MSC增殖作用有關(guān)。
　　 7、應(yīng)用aFGF纖維蛋白凝膠處理組運動終板附近分布了較多毛細血管,微循環(huán)良好；而未經(jīng)aFGF纖維蛋白凝膠處理的運動終板附近

18、毛細血管稀疏,微循環(huán)較差；說明aFGF具有明顯的促血管形成及改善微循環(huán)作用。
　　 8、應(yīng)用aFGF纖維蛋白凝膠處理組運動終板附近毛細血管aFGFR表達陽性率及表達量高于未經(jīng)aFGF纖維蛋白凝膠處理組,進一步說明aFGF纖維蛋白凝膠預(yù)防運動終板退變及肌萎縮的途徑在于其作用于毛細血管,改善運動終板附近微循環(huán),彌補失神經(jīng)支配肌的神經(jīng)營養(yǎng)作用。
　　 9、本實驗通過肌衛(wèi)星細胞及運動終板附近微循環(huán)的形態(tài)觀察提示給運動終板及肌肉人