靶向調(diào)控IFITM5基因的miR-762抑制Saos-2細胞礦化的研究.pdf

1、干擾素誘導跨膜蛋白5(interferon induced transmembrane protein5，IFITM5)是干擾素誘導跨膜蛋白家族成員之一，具有促進成骨細胞礦化的作用。在成骨細胞分化階段表達量增加，尤其是骨基質(zhì)形成期和礦化階段達到峰值。V型成骨不全患者中均發(fā)現(xiàn)存在IFITM5基因的5'UTR的c.-14C＞T突變，該類患者臨床特征主要是前臂骨間膜鈣化和增生性骨痂形成。
　　microRNA(miRNA)是一類長度21

2、-23個核苷酸，廣泛存在于多物種的內(nèi)源性、非編碼單鏈RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達。已證實miRNA廣泛參與了多種生理病理過程，如細胞增殖、分化、凋亡。研究表明miRNA可靶向調(diào)控成骨細胞分化過程中的關鍵基因以調(diào)控成骨細胞的分化。但是，到目前為止，還沒有生物學證據(jù)發(fā)現(xiàn)靶向調(diào)控成骨細胞礦化相關基因IFITM5的miRNA，從而調(diào)控成骨細胞的礦化。
　　目的:本研究旨在發(fā)現(xiàn)靶向調(diào)控IFITM5基因的microRNA，并驗證micr

3、oRNA對成骨細胞礦化、分化的影響。
　　方法:應用TargetScan、miRanda、Microcosm和DIANA-microT等4個靶標預測軟件中至少兩個預測結(jié)果的交集來判定microRNA和IFITM5是否存在靶標關系。人工合成microRNA mimics，并構(gòu)建野生型、突變型pmirGLO-IFITM5-3'UTR雙熒光素酶報告載體，通過FuGENE HD轉(zhuǎn)染Saos-2細胞，檢測螢火蟲熒光素酶相對活性以篩選出結(jié)合于

4、IFITM5-3'UTR的microRNA，進一步通過Western blotting檢測篩選出顯著下調(diào)IFITM5蛋白的microRNA。最終篩選出的microRNA轉(zhuǎn)染Saos-2細胞后，誘導礦化后采用茜素紅染色法觀察礦化結(jié)節(jié)的形成，并應用實時熒光定量PCR檢測分化標志蛋白ALP、OCN、Runx2等基因的表達。
　　結(jié)果:(1)生物信息學預測出28個相關microRNA，其中15個為三個及以上數(shù)據(jù)庫共有。(2)通過野生型雙熒

5、光素酶報告載體與microRNA mimics共轉(zhuǎn)染Saos-2細胞，以實驗組熒光值相對于對照組下調(diào)30％以上為原則，篩選出miR-1296、miR-2861、miR-4316、miR-661、miR-762;構(gòu)建上述五個突變型雙熒光素酶報告載分別與各自microRNA mimics共轉(zhuǎn)染Saos-2細胞，篩選出miR-2861、miR-4316、miR-762。(3)將上述三個microRNA轉(zhuǎn)染到Saos-2細胞，Western b

6、lotting結(jié)果顯示miR-762、miR-4316顯著降低IFITM5蛋白表達水平。(4)茜素紅染色實驗發(fā)現(xiàn)，相對于空白對照組，在誘導礦化72h后miR-762組均抑制礦化結(jié)節(jié)的形成;實時熒光定量PCR檢測礦化標志蛋白ALP、OCN、Runx2，相比于對照組，miR-762組ALP、OCN、Runx2的mRNA表達量均下降。
　　結(jié)論:篩選出負向調(diào)控IFITM5的miR-762、miR-4316，并驗證了miR-762抑制成骨