MiR-188-5p靶向AAC11抑制肝細(xì)胞癌生長和侵襲轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、背景和目的：肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在亞洲東部和非洲南部的發(fā)病率相對較高。HCC惡性程度較高，全球每年HCC死亡病例數(shù)高達(dá)600，000，高居全球癌癥死因的第三位。雖然目前HCC的治療手段已取得顯著進(jìn)步，但其5年生存率仍長期徘徊于3096～40％。究其原因在于，目前依然對晚期肝癌和肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移缺乏有效的治療手段。累積的研究發(fā)現(xiàn)，HCC的發(fā)生和發(fā)展是一多步驟的復(fù)雜

2、過程，其中涉及到眾多的生長因子、癌基因和抑癌基因的異常表達(dá)或激活。因而，闡明HCC發(fā)生發(fā)展過程中的分子機(jī)制對HCC的診斷、預(yù)防和治療就顯得尤為重要。在過去的幾十年間，國內(nèi)外學(xué)者在該領(lǐng)域開展了大量研究，并已發(fā)現(xiàn)p53、Rb、PI3K/AKT/mTOR、Ras/MAPK及Egf17等一系列與肝癌發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)的基因或信號通路。盡管如此，HCC發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制仍然大部分未知。
　　 微小RNA(microRNA，miRNA)

3、是一類長度為17-25個核苷酸的非編碼調(diào)控RNA。MiRNAs作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，可與其靶基因信使RNAs(messenger RNAs，mRNAs)的3’非讀碼區(qū)(3’untranslatedregion，3’-UTR)特異性結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因mRNAs的降解或抑制其翻譯，負(fù)性調(diào)控其靶基因的表達(dá)。自1993年Ambros和Ruvkun等發(fā)現(xiàn)并報(bào)道第一個miRNA以來，大量的miRNAs及其相關(guān)文獻(xiàn)被鑒定和發(fā)表，miRNAs研究已成為當(dāng)今

4、生命科學(xué)研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。迄今在人類基因組中檢測并證實(shí)的miRNAs已超過1000個。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs參與了生命過程中的一系列重要進(jìn)程，包括腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。最近的多項(xiàng)研究證實(shí)，miRNAs在HCC的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，可調(diào)控HCC細(xì)胞的生長、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移和DNA甲基化等眾多病理進(jìn)程。盡管，miRNAs在肝癌發(fā)生發(fā)展調(diào)控中的重要性業(yè)已吸引了國內(nèi)外眾多學(xué)者的關(guān)注，絕大多數(shù)miRNAs在肝癌中的作用及其作用機(jī)制依然未知，迫切需

5、要進(jìn)一步研究。
　　 此前，我們在長期的臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)并命名了一特殊類型的肝癌-孤立性大肝癌(Solitary large hepatoceliular carcinoma，SLHCC)，系指病灶呈單個、直徑大于5cm、呈膨脹性生長、常有包膜或假包膜的一類大肝癌。據(jù)此，我們將肝癌按照大體類型分為三類：SLHCC、結(jié)節(jié)性肝癌(結(jié)節(jié)數(shù)≥2個；Nodular HCC，NHCC)和小肝癌(腫瘤直徑≤5cm：Small HCC，SHCC)

6、。進(jìn)一步研究證實(shí)，SLHCC具有相對獨(dú)特的臨床病理特征，且其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移潛能與SHCC相近，均顯著低于NHCC。根治性肝切除術(shù)后，SLHCC的總生存時間和無瘤生存時間與SHCC相比無顯著性差異，但顯著性優(yōu)于NHCC。為深入了解SLHCC的分子病理特點(diǎn)，我們采用基因芯片技術(shù)比較了三種類型肝癌之間的基因表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7.89％(668/8464)的基因在SLHCC、SHCC和NHCC之間存在差異表達(dá)。以上結(jié)果提示上述三種類型肝癌具備各自獨(dú)

7、特的臨床病理和分子病理特點(diǎn)?；趍RNAs可調(diào)控人類基因組中30％的基因表達(dá)這一事實(shí)，我們推測，SLHCC、SHCC和NHCC亦可能具有各自獨(dú)特的miRNAs表達(dá)譜。
　　 為驗(yàn)證這一假說，我們在本研究中首先利用miRNAs芯片技術(shù)比較了SLHCC、SHCC和NHCC的miRNAs表達(dá)譜，以篩選三者之間的差異表達(dá)miRNAs。我們選取在三者中存在差異表達(dá)的miR-188-5p作為研究對象，深入研究了其在肝癌中的表達(dá)、生物學(xué)功能及

8、其作用的分子機(jī)制。我們的研究結(jié)果證實(shí)，miR-188-5p在肝癌內(nèi)表達(dá)顯著性下調(diào)，并與肝癌患者的預(yù)后顯著性相關(guān)，且過表達(dá)miR-188-5p可在體內(nèi)外抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移；而抗凋亡克隆11(Antiapoptosis clone11，AAC11)基因系miR-188-5p的直接功能性靶基因。我們的研究結(jié)果表明，miR-188-5p可作為肝癌預(yù)后監(jiān)測的新標(biāo)志物和治療的新型靶點(diǎn)。
　　 方法和結(jié)果：
　　 1.SLH

9、CC、SHCC和NHCC中差異表達(dá)miRNAs的篩選：利用miRNA芯片分析，我們檢測了SLHCC、SHCC和NHCC中的miRNAs表達(dá)譜，我們發(fā)現(xiàn)，miR-188-5p的表達(dá)水平在SLHCC和SHCC中無顯著性差異，但均顯著高于NHCC。這種表達(dá)差異與上述三種類型肝癌之間臨床病理特征的差異具有一致性，提示miR-188-5p可能參與了肝癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控。因而，我們選取miR-188-5p作為進(jìn)一步深入研究的對象。
　　 2.

10、miR-188-5p在肝癌內(nèi)的表達(dá)水平顯著性下降：我們采用實(shí)時定量RT-PCR技術(shù)，檢測了72例肝癌組織及其對應(yīng)的鄰近非癌肝組織(adjacent nontumorous liver tissue，ANLT)內(nèi)miR-188-5p的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與ANLTs相比，miR-188-5p在HCC內(nèi)的表達(dá)水平顯著性下調(diào)，平均下調(diào)倍數(shù)為3.75倍。且與芯片結(jié)果相一致的是，miR-188-5p在SLHCC中的表達(dá)水平與SHCC相近(0.52

11、 vs.0.65，P=0.017)，但顯著性高于NHCC(0.52 vs.0.21，P<0.001)。此外，我們進(jìn)一步分析了miR-188-5p與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，通過檢測其在ANLT、HCC和靜脈癌栓(vein cancer embolus of HCC，HCC-M)中的表達(dá)水平，我們發(fā)現(xiàn)，HCC-M中miR-188-5p的表達(dá)水平最低(相對表達(dá)水平分別為1.0、0.57和0.12)，提示miR-188-5p的表達(dá)水平與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)

12、移潛能呈反比。
　　 3.miR-188-5p低表達(dá)與HCC臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)：我們根據(jù)qRT-PCR結(jié)果，將72例肝癌分為miR-188-5p高表達(dá)組(n=27)和低表達(dá)組(n=45)，并分析了其表達(dá)水平與肝癌臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示，miR=188=5p表達(dá)水平與HCC的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目(P=0.010)和有無靜脈浸潤(P=0.002)密切相關(guān)。此外，miR-188-5p高表達(dá)HCC患者的總體生存時間及無瘤生存

13、時間均明顯高于miR-188-5p低表達(dá)的HCC患者(中位生存時間，35個月vs.16個月，P=0.044；中位無瘤生存時間，23個月vs.14個月，P=0.048)。
　　 4.miR-188-5p抑制肝癌的生長和侵襲轉(zhuǎn)移：我們首先檢測了miR-188-5p在2種正常肝細(xì)胞系(LO2和CCL13)和3種具有不同復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞系(HepG2、MHCC97-L和HCCLM3)內(nèi)的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，miR-188-5p在肝

14、癌細(xì)胞系內(nèi)的表達(dá)水平顯著低于正常肝細(xì)胞系，且在具備最高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移潛能的HCCLM3細(xì)胞系內(nèi)的表達(dá)水平最低(相對表達(dá)水平依次為：1.0、0.62、0.45、0.41和0.06)。
　　 我們選取HCCLM3作為研究對象，采用慢病毒介導(dǎo)的過表達(dá)技術(shù)，建立了miR-188-5p穩(wěn)定過表達(dá)HCCLM3肝癌細(xì)胞系和相應(yīng)的對照細(xì)胞系-HCCLM3 miR-188-5p和HCCLM3control細(xì)胞系，進(jìn)了檢測了兩者之間細(xì)胞生物學(xué)行為的差異。

15、結(jié)果顯示，HCCLM3miR-188-5p細(xì)胞的生長速度顯著慢于HCCLM3control細(xì)胞(P<0.005)；集落形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)，相比于HCCLM3contaol細(xì)胞，HCCLM3miR-188-5p細(xì)胞的集落數(shù)目減少了60％以上(200±30 vs.75±18，P<0.001)；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HCCLM3 miR-188-5p細(xì)胞的劃痕愈合能力顯著慢于HCCLM3control細(xì)胞(94％vs.48％，P<0.01)；基質(zhì)膠Tr

16、answell侵襲小室實(shí)驗(yàn)的結(jié)果亦顯示，HCCLM3 miR-188-5p細(xì)胞遷移運(yùn)動能力較HCCLM3control細(xì)胞明顯下降(50±9 vs.125±15，P<0.001)。
　　 5.AAC11是miR-188-5p的直接靶基因：采用生物信息學(xué)軟件miRanda(microma.org和miRbase)和TargetScan搜尋miR-188-5p的潛在靶基因，發(fā)現(xiàn)AAC11在其3'-UTR存在兩個miR-188-5p的

17、結(jié)合位點(diǎn)。其中，一結(jié)合位點(diǎn)在黑猩猩、恒河猴、狗、貓、馬和人等不同物種間存在高度保守性，而另一結(jié)合位點(diǎn)僅在恒河猴和人之間存在保守性。為進(jìn)一步證實(shí)miR-188-5p能否直接與AAC11的3'-UTR結(jié)合，我們構(gòu)建了包含AAC113'-UTR全長序列、結(jié)合位點(diǎn)1序列(野生型和突變型)或結(jié)合位點(diǎn)2序列(野生型和突變型)的熒光素酶報(bào)告基因載體。熒光素酶報(bào)告基因分析證實(shí)，miR-188-5p可與AAC11的全長3’-UTR結(jié)合，并顯著抑制其熒光素

18、酶的信號強(qiáng)度(約70％)，而突變型則不影響其信號強(qiáng)度。Western blot分析亦證實(shí)，miR-188-5p的過表達(dá)可顯著抑制HCCLM3細(xì)胞的內(nèi)源性AAC11的蛋白表達(dá)水平。以上結(jié)果提示，AAC11是miR-188-5p的直接下游靶基因。
　　 6.AAC11表達(dá)水平的恢復(fù)可消除miR-188-5p過表達(dá)誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞生長和侵襲轉(zhuǎn)移抑制：為進(jìn)一步證實(shí)miR-188-5p調(diào)控細(xì)胞生長和侵襲轉(zhuǎn)移的能力是否通過AAC11，我們構(gòu)建

19、了AAC11的慢病毒過表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)入HCCLM3miR-188-5p細(xì)胞中，以恢復(fù)AAC11的表達(dá)水平。生長曲線分析、集落形成實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)及基質(zhì)膠Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均顯示，AAC11表達(dá)水平恢復(fù)后，HCCLM3miR-188-5p細(xì)胞的細(xì)胞生長和侵襲轉(zhuǎn)移能力亦得到恢復(fù)，提示AAC11是miR-188-5p的功能性靶基因。
　　 7.miR-188-5p過表達(dá)可在體內(nèi)抑制肝癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移：為在活體

20、內(nèi)觀察miR-188-5p過表達(dá)對HCC生長和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，我們構(gòu)建了裸鼠原位肝癌轉(zhuǎn)移模型。結(jié)果顯示，HCCLM3miR-188-5p細(xì)胞形成的肝臟原位腫瘤體積明顯小于HCCLM3control細(xì)胞(P<0.05)，而HCCLM3miR-188-5p+AAC11細(xì)胞形成的肝臟原位瘤體積明顯大于HCCLM3miR-188-5p細(xì)胞(P<0.05)，但與HCCLM3control細(xì)胞相比明顯差異(P>0.05)。裸鼠肝和肺臟的連續(xù)切片

21、觀察結(jié)果顯示，HCCLM3miR-188-5p腫瘤無肝內(nèi)和遠(yuǎn)處肺內(nèi)轉(zhuǎn)移，而HCCLM3control腫瘤的肝內(nèi)和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移率分別為100％和80％，兩者相比具有顯著性差異(P<0.05)。此外，恢復(fù)AAC11表達(dá)后，HCCLM3的侵襲轉(zhuǎn)移能力已得到了大部分恢復(fù)，其肝內(nèi)和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移率分別為80％和60％。我們的這些結(jié)果證明，體內(nèi)過表達(dá)miR-188-5p可通過靶向AAC11抑制HCC的生長、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移及肺轉(zhuǎn)移。
　　 主要創(chuàng)新點(diǎn)：

22、>　　 1、本研究首次發(fā)現(xiàn)miR-188-5p在HCC中低表達(dá)，且其表達(dá)水平與HCC臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)，提示miR-188-5p是一個新的HCC預(yù)后標(biāo)志物，這首次將miR-188-5p引入了HCC及惡性腫瘤研究領(lǐng)域。
　　 2、本研究首次證實(shí)了miR-188-5p在HCC生長和侵襲轉(zhuǎn)移調(diào)控中具有重要作用，并闡明了miR-188-5p通過靶向AAC11抑制肝癌細(xì)胞生長和遷移運(yùn)動的分子機(jī)制，有助于加深對肝癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制

23、的了解。
　　 3、本研究通過動物實(shí)驗(yàn)證明，miR-188-5p的過表達(dá)可在動物活體內(nèi)顯著抑制HCC的生長、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移，提示miR-188-5p可作為是一個新的HCC干預(yù)治療的靶點(diǎn)，在HCC分子干預(yù)研究中具有重要價(jià)值。
　　 結(jié)論：本研究首次發(fā)現(xiàn)miR-188-5p在HCC中呈低表達(dá)并與肝癌的臨床病理特征和預(yù)后顯著相關(guān)，進(jìn)而闡明了miR-188-5p通過靶向AAC11抑制肝癌細(xì)胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，揭示了m