模擬缺血-再灌注損傷誘導(dǎo)胃粘膜上皮細胞凋亡及NF-κB在其中的作用.pdf

1、目的:缺血-再灌注(I/R)損傷是一種常見的臨床病理生理過程，臨床上因I/R損傷導(dǎo)致的急性臟器功能衰竭十分常見。胃腸道黏膜是人和動物體內(nèi)最易受損的組織，遠比其它臟器更易發(fā)生缺血-再灌注損傷，有鑒于此，對于各種病理性原因引起的胃I/R很有深入研究的必要。NF-κB是一類具有多項轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核蛋白因子，它與細胞凋亡的關(guān)系密切，參與了多種凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。本實驗室以往研究的是夾閉腹腔動脈30min所致胃缺血-再灌注后細胞凋亡的發(fā)生，但

2、由于體內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性，不可能排除諸多因素的干擾，也難以特異性的針對胃黏膜某一細胞進行研究。因此，對于離體胃黏膜上皮細胞缺氧/復(fù)氧后細胞調(diào)亡的研究有十分重要的意義。此外，本實驗室研究提示，大鼠單純胃缺血-再灌注后，對NF-κB有激活作用；NF-κB的活性增加具有促進細胞凋亡、加劇細胞損傷的作用。本課題采用胃黏膜上皮細胞株建立模擬缺血-再灌注損傷模型，觀察在復(fù)灌不同時間點模擬缺血-再灌注損傷誘導(dǎo)胃黏膜上皮細胞凋亡的作用及NF-κB在模擬缺血

3、-再灌注損傷后的活性變化和NF-κB的抑制劑-PDTC對凋亡的影響。 方法: 1.模擬缺血模型建立及模擬缺血-再灌注損傷誘導(dǎo)胃黏膜上皮細胞凋亡的作用：本試驗采用北京腫瘤研究所提供的胃黏膜上皮細胞株進行體外培養(yǎng)并傳代，細胞以缺氧(5％CO2、1％O2、94％N2)+無糖KR液模擬缺血，復(fù)氧、復(fù)糖模擬再灌注誘導(dǎo)胃黏膜上皮細胞凋亡，用流式細胞儀法、Hoechst33258染色法觀察正常對照組及模型損傷組于模擬缺血1h復(fù)灌3、6

4、、12、24、48h細胞凋亡的情況及變化規(guī)律。 2.NF-κB在模擬缺血-再灌注后胃黏膜上皮細胞凋亡中的作用選擇模擬缺血1h復(fù)灌后6h，用免疫組化和Western blot法檢測模擬缺血1h復(fù)灌6h后正常對照組、模型損傷組NF-κB的蛋白表達、激活情況。 3.NF-κB抑制劑PDTC在模擬缺血-再灌注導(dǎo)致胃黏膜上皮細胞凋亡中的作用在進行模擬缺血再灌注損傷前24h，應(yīng)用NF-κB的抑制劑PDTC，然后按照模型組進行細胞損傷

5、，選擇模擬缺血1h復(fù)灌6h時，用Hoechst33258染色法觀察細胞凋亡的情況，并用流式細胞儀檢測不同劑量(5、10、20μmol·L-1)NF-κB的抑制劑PDTC對胃黏膜上皮細胞凋亡的影響。用免疫組化和Western blot法檢測模擬缺血1h復(fù)灌6h后正常對照組、模型損傷組及PDTC用藥組NF-κB的蛋白表達及PDTC對NF-κB的抑制情況。 結(jié)果: 1.胃黏膜上皮細胞的培養(yǎng)及傳代：倒置顯微鏡下觀察，胃黏膜上皮細

6、胞12～24h貼壁；24h后有可見少量上皮樣細胞從周邊爬出；48h后見細胞呈指數(shù)樣生長；72h后細胞已基本能達到融合，鏡下觀察可見細胞體積較大，細胞間緊密相連融合成片，核橢圓形，呈多邊鵝卵石鋪路樣。傳代后的細胞生長迅速，約2～3日后可傳代。證明本研究中胃黏膜上皮細胞的體外培養(yǎng)及傳代成功可行。 2.I/R損傷模型建立及模擬缺血-再灌注損傷誘導(dǎo)胃黏膜上皮細胞凋亡的作用：流式細胞儀分析細胞再灌注3、6、12、24、48h的凋亡率分別達

7、(2.34±0.27)％、(6.68±0.56)％、(2.84±0.68)％、(11.28±1.20)％、(19.20±1.03)％，其中以再灌注6h時凋亡顯著增高，24小時后凋亡再次增加。模擬缺血1h復(fù)灌6h時倒置顯微鏡下觀察到了胃黏膜上皮細胞的形態(tài)學(xué)變化、Hoechst染色法觀察到細胞凋亡核的變化。相關(guān)分析表明，模擬缺血再灌注損傷可以誘導(dǎo)胃黏膜上皮細胞凋亡，凋亡率于再灌注6h時出現(xiàn)明顯的增加。 3.NF-κB在模擬缺血-再灌注后胃黏

8、膜上皮細胞凋亡中的作用： 模擬缺血1h復(fù)灌6h時用免疫組化和Western blot法檢測正常對照組、模型損傷組NF-κB的表達、激活情況。免疫組化結(jié)果顯示：胃黏膜上皮細胞模擬缺血1h復(fù)灌6h后，細胞核內(nèi)NF-κB的表達明顯增高；Western blot結(jié)果顯示，細胞核內(nèi)NF-κB的蛋白表達增加，灰度值與正常對照組相比具有顯著性差異。 4、NF-κB抑制劑PDTC在模擬缺血-再灌注導(dǎo)致胃黏膜上皮細胞凋亡中的作用：

9、 (1)模擬缺血1h復(fù)灌6h時應(yīng)用NF-κB的特異性抑制劑PDTC(5、10、2 0μmol·L-1)，經(jīng)流式細胞儀檢測三個不同劑量組，胃黏膜上皮細胞凋亡百分率(三個劑量組的凋亡率分別為6.24±0.86％、3.27±0.33％、6.57±0.61％)，以10μmol·L-1組效果最好，5μmol·L-1和20μmol·L-1組與模型組相比盡管細胞凋亡率有所下降，但無顯著性差異。實驗結(jié)果表明：使用10μmol·L-1PDTC后培養(yǎng)胃黏膜

10、上皮細胞24h再模擬缺血-再灌注損傷細胞調(diào)亡率明顯下降，PDTC可抑制胃黏膜上皮細胞凋亡。 (2)模擬缺血1h復(fù)灌6h時用免疫組化和Western blot法檢測正常對照組、模型損傷組及PDTC預(yù)處理組NF-κB的表達、激活情況：免疫組化結(jié)果顯示：胃黏膜上皮細胞模擬缺血1h復(fù)灌6h后，細胞核內(nèi)NF-κB的表達明顯增高，在模擬缺血前應(yīng)用PDTC預(yù)處理細胞，可降低模擬缺血-再灌注損傷引起的細胞核NF-κB的表達；Western bl

11、ot結(jié)果顯示，在胃黏膜上皮細胞模擬缺血1h復(fù)灌6h后，細胞核內(nèi)NF-κB的活性明顯增高，與正常對照組相比具有顯著性差異，在模擬缺血前應(yīng)用PDTC預(yù)處理細胞，缺血-再灌注損傷后細胞核內(nèi)NF-κB灰度值明顯降低，有統(tǒng)計學(xué)意義灰度值。 結(jié)論: 1、成功地進行了胃黏膜上皮細胞體外培養(yǎng)并傳代，建立了物理方法的模擬缺血-再灌注細胞損傷模型，并經(jīng)流式細胞儀凋亡率分析、Hoechst核染色證實體外培養(yǎng)的胃黏膜上皮細胞在經(jīng)歷模擬缺血再灌注