甲基化調控的miR-130b在卵巢癌化療耐藥機制中的研究.pdf

1、卵巢癌（Ovarian cancer）是婦科腫瘤中死亡率最高的腫瘤，發(fā)病率居婦女所有的惡性腫瘤的第六位。死亡率高的主要原因是卵巢癌耐藥以及臨床早期難以診斷。卵巢癌細胞易于對化療藥物如順鉑、紫杉醇等產生耐藥性，從而導致治療失敗。卵巢癌耐藥極大的影響了卵巢癌的預后，因此研究卵巢癌耐藥的發(fā)生和發(fā)展的機制，繼而通過逆轉卵巢癌耐藥，能夠大大提高卵巢癌化療的效果。MicroRNAs（miRNAs）是一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA,長約20~

2、25個核苷酸?？赏ㄟ^堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據(jù)互補程度的不同指導沉默復合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。最近的研究表明miRNA 參與各種癌癥的發(fā)生發(fā)展。進一步研究表明，卵巢癌耐藥的發(fā)生發(fā)展過程也與miRNA 有著密切的關系。因此，本研究以miRNA 130b 為研究對象，揭示其在卵巢癌耐藥中的作用。
　　 第一部分miR-130b在卵巢組織中的表達狀況的研究
　　 目的:研究miR-130b在惡

3、性，良性卵巢腫瘤組織及正常卵巢組織中的表達差異。
　　 方法:提取47例惡性，7例良性卵巢腫瘤組織及16例正常卵巢組織的RNA。用莖環(huán)實時熒光定量法檢測miR-130b在組織中的相對表達水平。
　　 結果:miR-130b在正常卵巢組織，良性，惡性卵巢腫瘤組織中的表達呈下降趨勢。在FIGO分期為III～IV 期的患者中miR-130b的表達水平顯著低于I～II 期的患者。miR-130b表達水平與年齡及病理類型無明顯相關

4、性。在低表達miR-130b的惡性病例中復發(fā)率明顯高于高表達的惡性病例。
　　 結論:miR-130b在惡性卵巢組織中低表達，與FIGO分期呈負相關，并且與卵巢癌的復發(fā)相關。因此推測miR-130b 可能與卵巢癌耐藥相關。
　　 第二部分miR-130b在卵巢癌細胞耐藥機制中的作用研究
　　 目的:研究miR-130b在卵巢癌細胞耐藥中的作用，通過上調/下調其表達，檢測對細胞耐藥性的影響。
　　 方法：用

5、莖環(huán)實時熒光定量法測定miR-130b在卵巢癌耐藥細胞株A2780/TAX,A2780/DDP 及SKOV3/TAX中的表達。通過向細胞中轉染miR-130b模擬物mimics或者抑制物inhibitors，上調/下調miR-130b的表達，繼而用MTT 法檢測對細胞耐藥性的影響以及用細胞計數(shù)法檢測對細胞活性的影響。
　　 結果:miR-130b在卵巢癌耐藥細胞株A2780/TAX，A2780/DDP，SKOV3/TAX中的表達

6、較親本株A2780，SKOV3中明顯降低。通過轉染miR-130b mimics 進入卵巢癌耐藥細胞中，細胞耐藥性明顯下降；而轉染miR-130b inhibitors 進入卵巢癌親本株中，細胞耐藥性明顯增強。細胞活性結果與MTT 結果一致。
　　 結論:miR-130b在卵巢癌耐藥細胞中低表達，而增強其表達可以部分逆轉耐藥。
　　 第三部分miR-130b 受甲基化的調控
　　 目的:研究miR-130b的表達

7、是否受甲基化的調控，并進一步研究去甲基化對細胞耐藥性的影響。
　　 方法:提取26例卵巢癌組織及5例卵巢良性腫瘤組織的DNA，用定量甲基化特異性PCR法檢測其甲基化水平。在細胞水平檢測耐藥細胞株和親本株的甲基化水平，并且用去甲基化藥物5-aza-CdR 處理后，檢測對miR-130b 甲基化水平，miR-130b的表達水平，以及細胞耐藥性的影響。
　　 結果:miR-130b在卵巢癌組織的中的甲基化水平顯著高于良性卵巢腫

8、瘤組織，并且miR-130b在卵巢組織中的表達水平與甲基化水平呈明顯負相關。細胞水平研究發(fā)現(xiàn)，miR-130b在耐藥細胞株中的甲基化水平明顯高于親本株。用去甲基化藥物處理后，miR-130b的甲基化水平顯著降低，表達水平顯著上升，而且可以部分逆轉細胞耐藥性。
　　 結論:miR-130b的表達受甲基化的調控，去甲基化可以部分逆轉卵巢癌細胞耐藥。
　　 第四部分miR-130b 靶向作用于CSF-1
　　 目的:研

9、究miR-130b 靶向調控CSF-1。
　　 方法:用實時熒光定量法檢測29例惡性，7例良性卵巢腫瘤組織及10例正常卵巢組織的CSF-1 mRNA表達水平。免疫組化檢測組織中CSF-1的表達水平。轉染miR-130bmimics或者inhibitors 進入卵巢癌耐藥細胞后，qRT-PCR和ELISA檢測CSF-1的mRNA及蛋白表達水平。熒光素酶報告基因法檢測miR-130b與CSF-1 mRNA的3’-UTR的結合位點。<

10、br>　　 結果:卵巢惡性腫瘤組織中CSF-1 mRNA 水平較良性腫瘤及正常卵巢組織高。卵巢惡性腫瘤組織中CSF-1表達陽性率明顯高于良性卵巢組織。卵巢組織中CSF-1 mRNA的表達水平與miR-130b的表達水平呈顯著負相關。轉染miR-130b mimics 進入卵巢癌耐藥細胞株A2780/TAX，A2780/CP和SKOV3/TAX后，CSF-1 mRNA和蛋白水平顯著降低。而轉染了miR-130b inhibitors 進

11、入卵巢癌親本株A2780和SKOV3后，CSF-1 蛋白的表達水平顯著升高。熒光素酶報告基因表明miR-130b可特異性的與CSF-1 mRNA的3’-UTR 結合，抑制CSF-1的表達。
　　 結論:CSF-1 為miR-130b的靶基因。
　　 第五部分miR-130b 靶向調控CSF-1在卵巢癌耐藥中的作用機制
　　 實驗一研究CSF-1在卵巢癌耐藥中的作用
　　 目的:通過干擾CSF-1的表達，研

12、究CSF-1在卵巢癌耐藥中的作用。
　　 方法：ELISA 檢測CSF-1在卵巢癌耐藥細胞中的表達水平。合成干擾CSF-1的shRNA片段，定向克隆插入Supersilencing shRNA質粒表達載體pGPU6/GFP/Neo，獲得CSF-1shRNA表達載體。將CSF-1 shRNA 質粒瞬時轉染卵巢癌耐藥細胞株，MTT 法檢測細胞耐藥性。
　　 結果:CSF-1在卵巢癌耐藥細胞株中的表達水平顯著高于親本株。用sh

13、RNA 干擾CSF-1的表達后，卵巢癌耐藥細胞的耐藥性明顯下降。用shRNA下調CSF-1的表達后，耐藥細胞的增殖能力明顯下降。
　　 結論:下調CSF-1的表達可以逆轉卵巢癌細胞耐藥。
　　 實驗二 miR-130b 靶向調控CSF-1在卵巢癌耐藥中的作用機制
　　 目的:研究miR-130b 通過靶向調控CSF-1 對卵巢癌細胞的耐藥性的影響。
　　 方法:通過向親本株中同時轉染miR-130b in