靶向腫瘤間質(zhì)纖維蛋白分子探針的制備及磁共振成像的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 一、合成歸巢肽CREKA并驗(yàn)證其對(duì)腫瘤間質(zhì)纖維蛋白的靶向性，為進(jìn)一步的探針制備和腫瘤靶向成像奠定基礎(chǔ)。
　　 二、制備聚乳酸包被的超順磁性氧化鐵納米粒SPIO-PLA和靶向性分子探針SPIO-PLA-CREKA，通過(guò)理化性質(zhì)的表征及體外纖維蛋白凝塊的磁共振成像實(shí)驗(yàn)，探討SPIO-PLA-CREKA作為磁共振靶向?qū)Ρ葎┑目尚行浴?br>　　 三、通過(guò)小鼠腫瘤模型的體內(nèi)磁共振成像實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)靶向性分子探針SPI

2、O-PLA-CREKA對(duì)腫瘤的診斷價(jià)值。
　　 方法:
　　 一、歸巢肽CREKA的合成和靶向性驗(yàn)證
　　 1、歸巢肽CREKA的合成
　　 以Wang樹(shù)脂為載體，配合Fmoc氨基保護(hù)策略，固相合成五肽CREKA。第一個(gè)氨基酸與樹(shù)脂的連接采用對(duì)稱(chēng)酸酐法，反應(yīng)結(jié)束后用適量的吡啶和乙酸酐封閉樹(shù)脂上剩余的活性位點(diǎn)。后續(xù)氨基酸以HOBt/HBTU/DIEA為縮合劑依次連接。反應(yīng)完成后，以三氟乙酸為主切割試劑將目的

3、肽段從樹(shù)脂上裂解下來(lái)。合成產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜分離、純化、分析，質(zhì)譜分析鑒定。
　　 2、異硫氰酸熒光素( FITC)標(biāo)記CREKA
　　 在合成五肽CREKA的終末，即最后一位氨基酸半胱氨酸縮合反應(yīng)完成后，用同樣的方法將一個(gè)手臂氨基酸6-氨基己酸（Ahx）連接到樹(shù)脂肽的氨基端。通過(guò)FITC與Ahx上的氨基反應(yīng)，將FITC標(biāo)記在五肽CREKA的氨基端，生成終產(chǎn)物FITC-Ahx-CREKA。反應(yīng)完成后，以三氟乙酸為主切割試

4、劑將目的肽段從樹(shù)脂上裂解下來(lái)。合成產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜分離、純化，質(zhì)譜分析鑒定。
　　 3、FITC-Ahx-CREKA與血漿纖維蛋白凝塊體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)
　　 取人鮮血約10ml，用0.4％枸櫞酸鈉抗凝;2500rpm離心10min，除去血細(xì)胞，收集血漿再次離心除去剩余的血細(xì)胞，收集血漿置—80℃冰凍片刻。向血漿內(nèi)加入氯化鈣(CaCl2)溶液至Ca2+濃度為20mmol/L?；靹蚝蠓胖糜?7℃恒溫水浴，直到凝塊形成。制備的血

5、漿蛋白凝塊用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)清洗、離心，除去表面殘留的各種血清蛋白。將血漿纖維蛋白凝塊6等分，隨機(jī)平分為兩組，一組浸于FITC-Ahx-CREKA的PBS溶液，另一組浸于PBS中，放37℃恒溫水浴30min。取出凝塊，并用PBS反復(fù)清洗，離心，除去未結(jié)合的FITC-Ahx-CREKA。紫外燈照射35秒后，熒光顯微鏡下觀察并照相。
　　 4、FITC-Ahx-CREKA與腫瘤組織切片體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)
　　 取福爾馬林

6、固定的裸鼠卵巢癌移植瘤( SKOV-3)組織一塊，用OTC包埋后作3μm厚的冰凍切片，附貼于潔凈的載玻片上，固定。固定好的SKOV-3組織冰凍切片，去離子水沖洗。用FITC-Ahx-CREKA溶液孵育組織片30min，去離子水清洗3次，去除未結(jié)合的FITC-Ahx-CREKA。用紫外燈照射35秒后，熒光顯微鏡下觀察并照相。然后將SKOV-3組織冰凍切片做HE染色。
　　 5、小鼠腎癌Renca細(xì)胞的培養(yǎng)和動(dòng)物模型的建立
　

7、　 小鼠腎癌Renca細(xì)胞復(fù)蘇后，以DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)箱。在37℃、5％ CO2條件下培養(yǎng)48h后，用胰蛋白酶消化，臺(tái)盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)，細(xì)胞存活率在98％以上。無(wú)菌選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期瘤細(xì)胞，消化離心后棄去上清，加生理鹽水洗滌，800rpm離心5min，棄上清，重復(fù)洗滌一次;生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度至106/ml。Balb/c小鼠左側(cè)后背部皮膚常規(guī)消毒后，將細(xì)胞懸液接種至小鼠左側(cè)后背部皮下，每只小鼠接種0.1ml。常規(guī)飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)

8、。
　　 6、FITC-Ahx-CREKA與腫瘤組織體內(nèi)結(jié)合實(shí)驗(yàn)
　　 皮下荷Renca腎癌移植瘤Balb/c小鼠，腫瘤直徑約1.0cm時(shí)，尾靜脈注射FITC-Ahx-CREKA200μg/0.1ml生理鹽水。6小時(shí)后處死小鼠，取腫瘤組織，一半液氮冷凍，做冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察并照相;另一半福爾馬林固定，石蠟包埋切片，HE染色。
　　 二、SPIO-PLA-CREKA的制備、表征和體外成像
　　 1、

9、SPIO-PLA-CREKA納米粒的制備和表征
　　 (1) SPIO-PLA的制備
　　 將0.39g FeCl2·4H2O和1.08g FeCl3·6H2O溶于20ml去離子水中，配成Fe2+和Fe3+摩爾比1:2的反應(yīng)溶液。向反應(yīng)體系加入適量的左旋聚乳酸(PLA)，磁力攪拌器劇烈攪拌下，緩慢滴加氫氧化鈉(NaOH)溶液至pH值為10;密閉反應(yīng)容器，室溫下劇烈攪拌過(guò)夜。反應(yīng)溶液依次用轉(zhuǎn)速為1000、5000、1000

10、0、15000rpm梯度離心，收集上層懸液。懸液用截留分子量10000的透析袋透析，透析液為標(biāo)準(zhǔn)PBS，每24h更換透析液一次，在4℃條件下共透析3天，除去多余的PLA。透析后獲得的SPIO-PLA經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，濾過(guò)液分裝，密封后放置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　 (2) SPIO-PLA-CREKA的制備
　　 稱(chēng)取1.20mg EDC-HCl，用100μl碳酸鹽緩沖液（pH值8.3）溶解后，在磁力攪拌器攪

11、拌下滴加到1ml的SPIO-PLA懸液中;再取1.27mg sulf-NHS，用100μl碳酸鹽緩沖液（pH值8.3）溶解后，滴加到反應(yīng)體系;持續(xù)攪拌反應(yīng)10min。將5.0mg CREKA用500μl碳酸鹽緩沖液（pH值8.3）溶解后，滴加到反應(yīng)體系，攪拌反應(yīng)2h。反應(yīng)液經(jīng)分子篩柱層析(Sepharose4 Fast Flow，GE)分離、純化。純化后的SPIO-PLA-CREKA經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，濾過(guò)液分裝，密封后存放

12、于4℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 (3) SPIO-PLA和SPIO-PLA-CREKA的表征
　　 H-600型透射電鏡觀察SPIO-PLA和SPIO-PLA-CREKA的形態(tài)和大小。用HYL-1080型激光粒度分布儀V2.0測(cè)定SPIO-PLA和SPIO-PLA-CREKA的粒徑及分布。紅外光譜儀檢測(cè)干燥后的SPIO-PLA和SPIO-PLA-CREKA，對(duì)比分析二者的紅外吸收光譜。
　　 (4) MR成像實(shí)驗(yàn)和T2弛

13、豫時(shí)間測(cè)定
　　 配制6管鐵濃度分別為的0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mmol/L的SPIO-PLA-CREKA和SPIO-PLA懸液。Philips Achieva1.5T磁共振掃描儀獲得SE序列T2WI圖像，評(píng)價(jià)負(fù)性強(qiáng)化效果。并測(cè)定各管的T2弛豫時(shí)間。T2WI掃描條件:TR:527.3，TE:50ms，F(xiàn)OV:230×230mm，matrix:256×205，層厚:5mm。T2時(shí)間測(cè)定:TR:2000ms;

14、 TE:30～960ms，32回波，F(xiàn)OV:230×230mm，matrix:256×205，層厚:2mm，帶寬:40;激發(fā)次數(shù)為3次。
　　 2、血漿纖維蛋白凝塊的體外MR成像實(shí)驗(yàn)
　　 制備13個(gè)血漿纖維蛋白凝塊，方法:取13個(gè)試管，每管內(nèi)10ml抗凝后血漿;然后再向每管內(nèi)加CaCl2溶液至濃度為20mmol/L，混勻后置37℃水浴4h;待凝塊形成后用3500rpm離心10min，棄去上清;PBS反復(fù)清洗、離心，去除

15、表面殘留的各種血清蛋白。
　　 將血漿纖維蛋白凝塊隨機(jī)分為SPIO-PLA組和SPIO-PLA-CREKA組，每組6管，剩余一個(gè)為空白對(duì)照管。SPIO-PLA組再隨機(jī)分為SPIO-PLA1h和SPIO-PLA6h兩亞組，各3個(gè)管;SPIO-PLA-CREKA組也隨機(jī)分為SPIO-PLA-CREKA1h組和SPIO-PLA-CREKA6h兩亞組，各3個(gè)管。
　　 SPIO-PLA1h組3個(gè)管分別加入濃度為1.6、0.8、0

16、.4mmol/L的SPIO-PLA懸液0.5ml，置37℃水浴1h; SPIO-PLA6h組3個(gè)管分別加入濃度為1.6、0.8、0.4mmol/L的SPIO-PLA懸液0.5ml，置37℃水浴6h; SPIO-PLA-CREKA1h組分別加入濃度為1.6、0.8、0.4mmol/L的SPIO-PLA-CREKA懸液0.5ml，置37℃水浴1h; SPIO-PLA-CREKA6h組分別加入濃度為1.6、0.8、0.4mmol/L的SPIO

17、-PLA-CREKA懸液0.Sml，置37℃水浴6h?？瞻讓?duì)照管不作對(duì)比劑處理。孵育后，所有凝塊經(jīng)PBS反復(fù)清洗、離心，除去未結(jié)合的對(duì)比劑。
　　 Philips Achieva1.5T磁共振掃描儀，TSE序列采集T2WI圖像，TR:4015.3ms，TE:110ms, FOV:230×230mm, matrix:256×205，層厚:2mm。
　　 3、抑制實(shí)驗(yàn)
　　 新鮮血漿制備9個(gè)血漿纖維蛋白凝塊，方法同上

18、，分別放入9個(gè)小的離心管內(nèi)，隨機(jī)分為A、B、C組，每組3管。先取5mg CREKA肽，用1.5ml PBS溶解，加到A組的3個(gè)管內(nèi)，每管0.5ml。B組和C組各管均加0.5ml PBS。然后分別向A、B組各管加入鐵濃度為1.6mmol/L的SPIO-PLA-CREKA，各0.5ml;C組各加0.5ml鐵濃度為1.6mmol/L的SPIO-PLA。三組凝塊均置37℃水浴1h。取出血漿纖維蛋白凝塊，用PBS反復(fù)清洗。Philips Achi

19、eva1.5T磁共振掃描儀，TSE序列采集T2WI圖像，具體掃描參數(shù)同上。
　　 三、腫瘤間質(zhì)靶向磁共振分子成像
　　 1、小鼠腎癌Renca細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型的建立
　　 小鼠腎癌Renca細(xì)胞培養(yǎng)于適量DMEM完全培養(yǎng)基，37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后，用胰蛋白酶消化，臺(tái)盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)，細(xì)胞存活率在98％以上。無(wú)菌選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期瘤細(xì)胞，消化離心后棄去上清，加生理鹽水沖洗，800rpm離心5min，

20、重復(fù)洗滌一次;生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度至106/ml。常規(guī)消毒皮膚后，將細(xì)胞懸液接種至Balb/c小鼠左側(cè)后背部皮下，每只小鼠接種0.1ml。常規(guī)飼養(yǎng)14-18天，待皮下腫瘤結(jié)節(jié)形成并長(zhǎng)大至直徑1.5cm左右時(shí)成像。
　　 2、小鼠腎癌模型的MR成像
　　 將皮下荷Renca腎癌移植瘤Balb/c小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。用戊巴比妥鈉（30mg/kg）按體重腹腔注射麻醉小鼠。將麻醉后小鼠固定于自制泡沫鼠床上，平掃獲得T2W

21、I圖像。增強(qiáng)掃描:實(shí)驗(yàn)組小鼠尾靜脈注射SPIO-PLA-CREKA，劑量為5mg Fe/kg體重;對(duì)照組小鼠尾靜脈注射SPIO-PLA，劑量為5mg Fe/kg體重。分別采集對(duì)比劑注射后60min、120min、180min各時(shí)間點(diǎn)兩組小鼠增強(qiáng)數(shù)據(jù)，觀察各時(shí)間點(diǎn)腫瘤增強(qiáng)情況。Philips Achieva1.5T磁共振掃描儀，膝關(guān)節(jié)線圈，TSE序列T2WI橫斷面掃描:TR:3047ms，TE:100ms，F(xiàn)OV:230×230mm，層厚

22、:5mm, matrix:256×205。
　　 圖像分析:測(cè)量感興趣區(qū)（Region of interest，ROI）內(nèi)信號(hào)強(qiáng)度(signalintensity，SI)，計(jì)算腫瘤在對(duì)比劑注射前和注射后各時(shí)間點(diǎn)的信噪比(signal tonoise ratio，SNR)。方法:在腫瘤內(nèi)勾畫(huà)盡可能大的ROI，測(cè)量ROI內(nèi)信號(hào)強(qiáng)度，每個(gè)腫瘤測(cè)量3次，取平均值，記為SIt;在與腫瘤同層面背景區(qū)域選取較大的ROI，測(cè)量背景噪聲SIn。計(jì)

23、算兩組腫瘤組織的信噪比SNR=SIt/SIn。
　　 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)處理軟件。SPIO-PLA-CREKA和SPIO-PLA增強(qiáng)前后不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤SNR的比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析。組內(nèi)增強(qiáng)前后各時(shí)間點(diǎn)腫瘤SNR的多重比較采用Bonfferoni法。增強(qiáng)前和增強(qiáng)后各時(shí)間點(diǎn)兩組間SNR的比較采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4、組織病理學(xué)檢查

24、　　 磁共振掃描結(jié)束后處死小鼠，切取腫癌組織，用福爾馬林固定，石蠟包埋。將石蠟包埋組織塊置切片機(jī)組織支承器上，做3μm厚的組織切片，置于潔凈的載玻片上，37℃干燥過(guò)夜。分別做HE染色，普魯士藍(lán)染色和伊紅復(fù)染。
　　 結(jié)果:
　　 一、歸巢肽CREKA的合成和靶向性驗(yàn)證
　　 1、歸巢肽CREKA的合成
　　 固相合成的歸巢肽CREKA為白色粉末。經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定，主峰分子量(m/z:[M+H]+)為606

25、.0，與CREKA的理論分子量604.71相符，證明合成正確。經(jīng)HPLC純化、分析，合成的CREKA純度為99.65％。
　　 2、FITC-Ahx-CREKA的合成
　　 FITC通過(guò)Ahx連接到五肽CREKA的氨基端，形成熒光肽FITC-Ahx-CREKA。合成產(chǎn)物為淡黃色粉末，經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定，主峰分子量為（m/z:[M+H]+）1108.5，與FITC-Ahx-CREKA的理論分子量1107.61相符，證明合成正確

26、。經(jīng)HPLC純化分析，合成的FITC-Ahx-CREKA的純度為98.13％。
　　 3、FITC-Ahx-CREKA與血漿纖維蛋白凝塊體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)
　　 經(jīng)FITC-Ahx-CREKA溶液孵育的血漿纖維蛋白凝塊，經(jīng)PBS清洗除去未結(jié)合的FITC-Ahx-CREKA后，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)綠色熒光，空白對(duì)照血漿蛋白凝塊無(wú)綠色熒光，證明FITC-Ahx-CREKA可以與血漿纖維蛋白凝塊特異性結(jié)合。
　　 4、FITC

27、-Ahx-CREKA與腫癌組織體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)
　　 SKOV-3組織冰凍切片經(jīng)FITC-Ahx-CREKA孵育后，PBS清洗去除非特異性結(jié)合的FITC-Ahx-CREKA，熒光顯微鏡下腫瘤組織切片內(nèi)見(jiàn)環(huán)狀綠色熒光。HE染色證實(shí)FITC-Ahx-CREKA的綠色熒光出現(xiàn)的部位為腫瘤血管壁和血管周?chē)g質(zhì)。
　　 5、小鼠Renca腎癌模型的建立
　　 6只Balb/c小鼠皮下接種小鼠Renca細(xì)胞，飼養(yǎng)14天后，有4只

28、小鼠左側(cè)后背部皮下可觸及瘤結(jié)節(jié)，1只未見(jiàn)腫瘤生長(zhǎng)，1只腫瘤沿皮膚生長(zhǎng)，皮膚表面破潰，未形成瘤結(jié)節(jié)。
　　 6、FITC-Ahx-CREKA與腫瘤組織體內(nèi)結(jié)合實(shí)驗(yàn)
　　 熒光顯微鏡下見(jiàn)冰凍切片腫瘤組織內(nèi)見(jiàn)大量綠色熒光，呈彌漫性分布，而正常組織內(nèi)未見(jiàn)綠色熒光。石蠟切片HE染色，腫瘤細(xì)胞有明顯異型性，核大深染，有明顯核仁，可見(jiàn)較多病理性分裂像。證實(shí)靶向分子探針FITC-Ahx-CREKA在活體內(nèi)可以與腫瘤組織特異性結(jié)合。

29、>　　 二、SPIO-PLA-CREKA的制備、表征和體外成像
　　 1、SPIO-PLA-CREKA納米粒的制備和表征
　　 所制備的SPIO-PLA和SPIO-PLA-CREKA均為棕黑色懸液，原子吸收分光光度法測(cè)定鐵含量分別為182.8mmol/L和167.4mmol/L。透射電子顯微鏡下見(jiàn)制備的SPIO-PLA和SPIO-PLA-CREKA納米顆粒呈球形殼核結(jié)構(gòu)，即氧化鐵顆粒核心包裹在較厚聚乳酸內(nèi)，大小均勻。紅

30、外光譜分析證實(shí)SPIO-PLA成功標(biāo)記CREKA。粒度分析儀測(cè)定SPIO-PLA納米粒中位粒徑124nm，體積平均粒徑為133nm，面積平均徑85nm，均勻性0.461。SPIO-PLA-CREKA中位粒徑136nm，體積平均粒徑為150nm，面積平均徑88nm，均勻性0.507。
　　 不同濃度SPIO-PLA-CREKA和SPIO-PLA懸液經(jīng)MR掃描SE序列T2WI圖像顯示:SPIO-PLA及SPIO-PLA-CREKA懸

31、液的T2信號(hào)均隨濃度的增加而減低。同濃度條件下SPIO-PLA-CREKA靶向?qū)Ρ葎┑腡2信號(hào)強(qiáng)度低于SPIO-PLA。T2時(shí)間測(cè)量結(jié)果顯示:隨著對(duì)比劑濃度的增高，T2時(shí)間逐漸縮短。同濃度條件下SPIO-PLA-CREKA靶向?qū)Ρ葎┑腡2值小于SPIO-PLA。說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)制備的SPIO-PLA對(duì)比劑及SPIO-PLA-CREKA靶向?qū)Ρ葎┚哂胸?fù)性造影效果，并存在一定的濃度效應(yīng)關(guān)系，即在一定濃度范圍內(nèi)，濃度越高，T2WI負(fù)性強(qiáng)化作用越明

32、顯。
　　 2、血漿纖維蛋白凝塊的體外MR成像
　　 在T2WI圖像上，SPIO-PLA組血漿蛋白凝塊的信號(hào)強(qiáng)度與空白對(duì)照管無(wú)明顯差別。SPIO-PLA-CREKA組血漿蛋白凝塊的信號(hào)強(qiáng)度明顯低于空白對(duì)照管，且隨著濃度的增高，信號(hào)降低越明顯。SPIO-PLA-CREKA組的兩個(gè)亞組中，6h組的信號(hào)強(qiáng)度明顯低于1h組。
　　 3、抑制實(shí)驗(yàn)
　　 只用SPIO-PLA-CREKA孵育的血漿纖維蛋白凝塊信號(hào)強(qiáng)度

33、較SPIO-PLA對(duì)照管明顯減低，而游離的CREKA和SPIO-PLA-CREKA共同孵育的血漿纖維蛋白凝塊信號(hào)強(qiáng)度較SPIO-PLA輕度減低。
　　 三、腫瘤間質(zhì)靶向磁共振分子成像
　　 1、小鼠腎癌腫瘤模型的建立
　　 15只Balb/c小鼠左側(cè)后背部皮下接種Renca腎癌細(xì)胞懸液，飼養(yǎng)14天后，有12只小鼠接種部位可觸及瘤結(jié)節(jié)，18天后，腫瘤增大至直徑1.5cm左右，用游標(biāo)卡尺精確測(cè)量，移植瘤平均最大徑為1

34、.45±0.43cm。建模成功率80％(12/15)。
　　 2、小鼠腎癌模型的MR成像
　　 TSE序列T2WI掃描結(jié)果顯示，平掃腫瘤呈均勻的高信號(hào)。增強(qiáng)掃描，實(shí)驗(yàn)組小鼠尾靜脈注射SPIO-PLA-CREKA后，腫瘤信號(hào)強(qiáng)度逐漸減低;對(duì)照組小鼠尾靜脈注射SPIO-PLA后，腫瘤信號(hào)強(qiáng)度無(wú)明顯變化。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)比劑注射前后腫瘤SNR有顯著性差異(F時(shí)間=88.249，P＜0.001)。對(duì)比劑和時(shí)間之間存

35、在交互效應(yīng)（F對(duì)比劑×?xí)r間=59.462，P＜0.001）。SPIO-PLA-CREKA組腫瘤的SNR顯著低于SPIO-PLA組(F對(duì)比劑=33.097，P＜0.001)。
　　 增強(qiáng)前后各時(shí)間點(diǎn)兩組間SNR的比較:注射前及注射后60min，SPIO-PLA-CREKA組和SPIO-PLA組間腫瘤SNR均無(wú)顯著性差異(30.08±0.66vs.30.13±0.76, t=0.122, P=0.905;29.48±0.82 vs.

36、29.97±0.85, t=1.002,P=0.340）;注射對(duì)比劑后120min，SPIO-PLA-CREKA組腫瘤SNR顯著低于及SPIO-PLA組(27.37±1.14 vs.29.62±0.68，t=4.159，P=0.002);注射對(duì)比劑后180min，SPIO-PLA-CREKA組腫瘤的SNR顯著低于SPIO-PLA組(24.22±0.48vs.29.53±0.56; t=17.652, P＜0.001)。
　　 3

37、、組織病理學(xué)檢查
　　 顯微鏡下見(jiàn)SPIO-PLA-CREKA組未染色腫癌組織切片血管壁及血管周?chē)霈F(xiàn)大量褐色鐵顆粒沉著，沿血管彌漫性分布，而正常組織內(nèi)未見(jiàn)鐵顆粒沉著。普魯士藍(lán)染色見(jiàn)腫瘤組織內(nèi)血管壁及血管周?chē)w粒藍(lán)染，微細(xì)血管清晰可見(jiàn);普魯士藍(lán)染色后伊紅復(fù)染，腫瘤細(xì)胞染為紅色，沿腫瘤微細(xì)血管彌漫性分布的藍(lán)染顆粒更加清晰。證實(shí)SPIO-PLA-CREKA靶向?qū)Ρ葎┰诨铙w內(nèi)可以與腫瘤間質(zhì)特異性結(jié)合，其結(jié)合部位為腫瘤組織內(nèi)血管壁及血管

38、周?chē)g質(zhì)。
　　 結(jié)論:
　　 1、成功合成了歸巢肽CREKA，純度達(dá)到99.65％，可滿足實(shí)驗(yàn)要求;
　　 2、成功制備了FITC-Ahx-CREKA，純度為98.13％，達(dá)到體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)的要求;
　　 3、FITC-Ahx-CREKA與血漿纖維蛋白凝塊、腫瘤組織體外及體內(nèi)結(jié)合實(shí)驗(yàn)均證明歸巢肽CREKA可特異性靶向腫瘤間質(zhì)內(nèi)纖維蛋白;
　　 4、制備了聚乳酸包被的超順磁性氧化鐵納米粒SPIO-

39、PLA，所制備的SPIO-PLA納米顆粒呈球形殼核結(jié)構(gòu)，大小均勻，分散性好，無(wú)聚集和重疊。在T2WI上具有負(fù)性強(qiáng)化效果;
　　 5、制備的SPIO-PLA-CREKA呈球形殼核結(jié)構(gòu)，大小均勻，分散性好，靜置后無(wú)分層。具有明顯縮短T2時(shí)間的作用，產(chǎn)生T2WI負(fù)性強(qiáng)化效果，可作為T(mén)2對(duì)比劑;
　　 6、靶向性探針SPIO-PLA-CREKA能與凝結(jié)的血漿纖維蛋白特異性結(jié)合，證明標(biāo)記SPIO-PLA后的CREKA仍保持原來(lái)的生