產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的篩選與酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一種昆蟲病原微生物，因其產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白而被開發(fā)為最成功的細(xì)菌殺蟲劑。幾丁質(zhì)酶基因在Bt中廣泛分布，迄今已從Bt不同亞種的菌株中克隆出多種幾丁質(zhì)酶基因，并進(jìn)行了初步酶活性和防病抗蟲等方面的研究。近幾年來，關(guān)于幾丁質(zhì)酶在蘇云金芽胞桿菌中的分布、產(chǎn)酶的條件、幾丁質(zhì)酶的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)、幾丁質(zhì)酶基因的克隆、以及幾丁質(zhì)酶在生物防治中的作用等方面的研究逐漸增加。開展幾丁質(zhì)酶的研究，對(duì)

2、幾丁質(zhì)資源的轉(zhuǎn)化，已成為全球性熱門科研課題。
　　本文通過透明圈法從土壤中，篩選出一株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株BtDLD171。DNS比色法測(cè)定菌株的酶活力，發(fā)現(xiàn)并無明顯顏色變化。根據(jù)已知Bt幾丁質(zhì)酶基因序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物，克隆得到BtDLD171的幾丁質(zhì)酶的基因序列，并在大腸桿菌Rosetta(DE3)中表達(dá)。Bt DLD171的chiA73基因編碼一個(gè)分子量為67kDa的蛋白，該蛋白具有一個(gè)由催化區(qū)域和幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)域組成的模塊結(jié)構(gòu)。用不

3、同的熒光底物研究幾丁質(zhì)酶活性，發(fā)現(xiàn)原菌發(fā)酵液既能水解4-MU-(GlcNAc)3，也可水解4-MU-GlcNAc，而表達(dá)的ChiA73只能水解4-MU-(GlcNAc)3，表明ChiA73為內(nèi)切幾丁質(zhì)酶。在pH4-10之間，該酶均具有水解酶的活性，在pH8時(shí)，活性最高。幾丁質(zhì)酶ChiA73的最適溫度為40℃。
　　本文采用透明圈方法，從40份土壤中篩選到4株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的非Bt菌株。DNS方法測(cè)定四株幾丁質(zhì)酶活性，最高的幾丁質(zhì)酶酶活

4、性為132 U/ml。將該菌株接種到PDA平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2-3d后，菌落小、呈白色、表面光滑、邊緣整齊、微突起、似細(xì)菌菌落、但是不透明。經(jīng)16S rRNA序列鑒定后表明:該菌為東方擬無枝酸菌，屬于稀有放線菌屬，命名為Amycolatopsis orientalis YM9-2。根據(jù)已知東方擬無枝酸菌HCCB10007全基因組序列中的幾丁質(zhì)酶基因序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)PCR引物，對(duì)該菌株進(jìn)行幾丁質(zhì)酶基因的克隆?？寺〉玫揭粋€(gè)大小約1 kb

5、的DNA序列和一個(gè)大小約1.6 kb的DNA序列，測(cè)序結(jié)果表明兩個(gè)序列均為幾丁質(zhì)酶基因。其中一個(gè)幾丁質(zhì)酶基因(GenBank登錄號(hào)為KP338820)的全長(zhǎng)序列為1056bp，編碼351個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其分子量為36.9 kDa，等電點(diǎn)為8.26。另一個(gè)幾丁質(zhì)酶基因（GenBank登錄號(hào)為KP338819）的全長(zhǎng)序列為1638 bp，編碼545個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其分子量為57.1 kDa，等電點(diǎn)為7.98。對(duì)Amycolatopsis ori