綠粘帚霉產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的條件優(yōu)化及其酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、綠粘帚霉fGliocladium virens)對(duì)多種病原菌都具有拮抗活性，是一種潛力巨大的生防菌，在林木病蟲害的生物防治中起著重要作用。國(guó)內(nèi)有關(guān)綠粘帚霉產(chǎn)幾丁質(zhì)酶及其生防特性的研究較少，大多為對(duì)綠粘帚霉的重寄生、競(jìng)爭(zhēng)作用以及抗菌代謝產(chǎn)物膠霉毒素的研究。就此，本研究以綠粘帚霉F051菌株為對(duì)象，研究綠粘帚霉F051產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最佳碳、氮源以及最優(yōu)培養(yǎng)條件；分離純化幾丁質(zhì)酶并對(duì)幾丁質(zhì)酶學(xué)性質(zhì)及其對(duì)三種病原真菌交鏈孢、鐮刀菌和立枯絲核菌菌絲

2、細(xì)胞壁的降解作用進(jìn)行研究。研究結(jié)果如下： 還原糖法測(cè)定，綠粘帚霉F051發(fā)酵上清液與膠態(tài)幾丁質(zhì)混合，再與.DNS反應(yīng)后，產(chǎn)生棕紅色物質(zhì)，說(shuō)明有幾丁質(zhì)酶的存在，即綠粘帚霉F05l可產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。綠粘帚霉F051只有在含有幾丁質(zhì)誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中發(fā)酵才能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，說(shuō)明綠粘帚霉F051產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶是一種誘導(dǎo)酶。 在葡萄糖，蔗糖，麥芽糖，乳糖四種碳源， (NH<,4>)<,2>SO<,4>，NH<,4>NO<,3>，蛋白胨，

3、酵母粉四種氮源中，經(jīng)測(cè)定，麥芽糖和酵母粉分別為碳源和氮源時(shí)，綠粘帚霉所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活最大，即麥芽糖和酵母粉為產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最佳碳、氮源。 綠粘帚霉F051產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的條件優(yōu)化，通過(guò)正交試驗(yàn)測(cè)定了溫度、pH值、瓶裝量、接種量、碳源和氮源的量對(duì)產(chǎn)酶的影響。研究表明碳源的量對(duì)綠粘帚霉F051產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響最大，其次是溫度，再次是瓶裝量；當(dāng)溫度為28℃，pH值等于7， 100mL的瓶裝量，接種1mL孢懸液且碳源和氮源的量分別為1.5％和0

4、.2％時(shí)幾丁質(zhì)酶活力最大，為產(chǎn)酶的最佳條件。 通過(guò)60％硫酸銨沉淀分離，再經(jīng)High Q陽(yáng)離子交換柱層析純化幾丁質(zhì)酶，經(jīng)SDS-PAGE測(cè)定，該幾丁質(zhì)酶分子量約為40KD。 對(duì)幾丁質(zhì)酶酶學(xué)性質(zhì)的研究表明，在20～80℃范圍內(nèi)，幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，隨后溫度升高幾丁質(zhì)酶活迅速下降；該酶在20～40℃水浴中保溫1h后，酶活基本穩(wěn)定，超過(guò)這個(gè)溫度酶活逐漸下降，80℃保溫1h酶活完全喪失。當(dāng)pH=4時(shí)酶活最大；在pH2

5、～8的不同緩沖液中預(yù)處理lh，幾丁質(zhì)酶在pH3～8范圍內(nèi)基本保持穩(wěn)定。金屬離子中Ba2<'2+>、Mn<'2+>、Sn<'2+>對(duì)幾丁質(zhì)酶有激活作用Sn<'2+>作用最強(qiáng)；Na<'+>、K<'+>、Mg<'2+>、Ca2+、Fe<'2+>對(duì)幾丁質(zhì)酶有抑制作用，F(xiàn)e<'2+>完全抑制幾丁質(zhì)酶活。不同濃度的有機(jī)溶劑處理幾丁質(zhì)酶，5％和20％的丙酮，5％的乙二醇和正丙醇對(duì)幾丁質(zhì)酶有激活作用，其余有機(jī)溶劑均對(duì)該酶有抑制作用。 幾丁質(zhì)粗酶