橙色紅曲菌pksCT gene的敲除和長(zhǎng)同源臂置換型打靶載體的構(gòu)建.pdf

1、本文采用PCR．分析方法對(duì)7種14株產(chǎn)桔霉素的紅曲菌中合成桔霉素基因——pksCT 的保守性進(jìn)行了研究；運(yùn)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建了紅曲菌pksCTgene的置換型打靶載體pHD116；通過原生質(zhì)體PEG介導(dǎo)和電擊轉(zhuǎn)化，利用pHD116敲除了橙色紅曲菌 (M.aurantiacus)AS3.4384 中的 pksCT gene ，并對(duì)該基因缺失株的產(chǎn)毒、產(chǎn)色素等功能進(jìn)行了分析研究。本文還對(duì)運(yùn)用 RecET 重組系統(tǒng)對(duì)快速構(gòu)建長(zhǎng)同源臂置換型打

2、靶載體的方法進(jìn)行了初步探討，為紅曲菌基因打靶研究提供了一個(gè)快速構(gòu)建長(zhǎng)同源臂載體的途徑。本文的主要研究結(jié)果如下： 1、采用PCR分析方法，從14株紅曲菌的基因組DNA中均擴(kuò)增到 pksCT基因的翻譯起始區(qū)部分序列(668bp)和終止密碼子區(qū)部分序列(591bp)，擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果通過NCBI進(jìn)行BLAST同源性分析，結(jié)果表明，本文中選用14個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物的序列之間具有高度同源性，且分別與Genbank中紫色紅曲菌中的pksCTgen

3、e啟動(dòng)子和終止密碼子區(qū)部分序列一致。結(jié)果顯示pksCT在14株產(chǎn)桔霉素紅曲菌菌株中具有高度地保守性。 2、以紅曲菌中合成桔霉素基因——pksCT為靶基因，以高產(chǎn)桔霉素的橙色紅曲菌(M.aurantiacusr)AS3.4384的基因組DNA為模板，擴(kuò)增靶基因pksCT的翻譯起始區(qū)部分序列(65-733)A和終止密碼子區(qū)部分序列(8349-8940) B為靶基因的同源臂序列。通過酶切、連接和轉(zhuǎn)化等DNA重組技術(shù)，成功地構(gòu)建了一個(gè)兩

4、端含pksCT gene 同源臂序列、中間為潮霉素抗性基因的置換型打靶載體——pHD116。該載體中靶基因pksCT gene 的同源臂序列，能靶向性精確地界定并敲除基因組上的靶基因，并通過潮霉素B抗性篩選靶基因缺失株。 3、優(yōu)化了紅曲菌原生質(zhì)體PEG介導(dǎo)和電擊轉(zhuǎn)化體系中原生質(zhì)體的濃度以及打靶載體質(zhì)粒DNA量的條件，并利用原生質(zhì)體PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化和電擊轉(zhuǎn)化將置換型打靶載體 pHD116 轉(zhuǎn)入橙色紅曲菌(M.aurantiacus)

5、AS3.4384中，敲除了靶基因pksCT gene，采用潮霉素抗性篩選和基因組DNA的PCR擴(kuò)增法篩選，獲得一株pksCT gene缺失株P(guān)HDS26，其桔霉素表達(dá)量比原始菌株降低了97.2％，同時(shí)紅色色素和黃色色素的表達(dá)量分別提高了49.4％和28.8％。 4、合成一對(duì)引物，分別在它們的5'端設(shè)計(jì)與pHD116上潮霉素B抗性基因和上pUc18載體同源的55bp短序列；以橙色紅曲菌的基因組DNA為模板，PCR 擴(kuò)增 pksCT