新生兒窒息后血清誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制研究.pdf

1、背景：新生兒窒息可以發(fā)生在產(chǎn)前，產(chǎn)時(shí)或者產(chǎn)后期。我國(guó)現(xiàn)在每年出生約2000萬(wàn)新生兒，窒息發(fā)生率占活產(chǎn)新生兒的5％-10％，新生兒窒息是當(dāng)前我國(guó)新生兒死亡的第一位死因，也是致殘的重要原因。窒息后多臟器血流動(dòng)力學(xué)變化和各臟器間的血流再分配可導(dǎo)致多器官功能損傷，即缺血再灌注損傷。相關(guān)研究表明窒息后的多器官功能損傷中腎損傷的發(fā)生率最高，而腎小管作為腎單位的主要結(jié)構(gòu)之一，其損傷發(fā)生最早，進(jìn)一步證明損傷最早、最敏感的靶細(xì)胞是腎近曲小管上皮細(xì)胞。

2、 前期研究發(fā)現(xiàn)，新生兒窒息后腎損傷組外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于非損傷組，且與腎功能損傷程度呈正相關(guān)；在窒息大鼠恢復(fù)供氧的模型中進(jìn)一步觀察到腎組織白細(xì)胞滯留數(shù)明顯增多。說(shuō)明一些炎癥細(xì)胞因子(IL-8,TNF-α等)及大量氧自由基的產(chǎn)生對(duì)窒息的發(fā)病及腎損傷的發(fā)生起重要作用。我們還觀察到用新生兒窒息后血清來(lái)處理培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞其凋亡率增加，證明凋亡是窒息后腎損傷的一種形式。但是，窒息后血清誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制仍不清楚。

3、 線粒體作為真核細(xì)胞內(nèi)能量生成的場(chǎng)所，是窒息后細(xì)胞損傷最敏感的細(xì)胞器。而且在細(xì)胞凋亡內(nèi)外多條信號(hào)通路中，線粒體通過(guò)釋放各種凋亡蛋白形成調(diào)控細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)。那么，在窒息后血清誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡中是否有線粒體途徑的激活呢? 核因子-kB(NF-kB)作為調(diào)節(jié)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子之一，是炎癥反應(yīng)的觸發(fā)器及關(guān)鍵環(huán)節(jié)。已證實(shí)NF-kB是調(diào)節(jié)編碼多種前炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子和粘附分子基因的重要轉(zhuǎn)錄因子。目前研究證實(shí)窒息后血清誘

4、導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡的機(jī)制牽涉到NF-kB的活化。活化后的核因子-kB是否參與線粒體途徑的激活呢? 因此，本研究在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，探討新生兒窒息后血清對(duì)HK-2細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位變化，相關(guān)凋亡蛋白釋放以及促凋亡蛋白表達(dá)的影響及其與NF-kB活化的關(guān)系，旨在闡明窒息后腎小管損傷的機(jī)制。 目的：研究新生兒窒息后血清誘導(dǎo)人近曲腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)凋亡的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。 方法： (1)以人近曲腎小管上皮細(xì)

5、胞(HK-2)為研究對(duì)象，用含10％胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 (2)新生兒窒息后血清的制備：選擇2006年9月～2007年6月在我科住院的未使用免疫抑制劑、無(wú)明顯感染性疾病的足月重度室息新生兒。在窒息后24h抽取外周血5mL(肝素抗凝)，離心并分離出血清，滅活補(bǔ)體后-20℃保存?zhèn)溆谩?(3)窒息后血清誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷模型的建立：采用上述方法處理的窒息后血清，用DMEM/F12培養(yǎng)液配成20％

6、(體積比，v/v)的攻擊濃度，攻擊正常培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞。 (4)實(shí)驗(yàn)分組：共分為三組，即正常對(duì)照組、窒息組和吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)干預(yù)組。PDTC是NF-kB的特異性抑制劑，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用的終濃度為40μM。即在實(shí)驗(yàn)前24h將培養(yǎng)液換成含20％窒息血清的DMEM培養(yǎng)液的同時(shí)加入40μM PDTC。 (5)檢測(cè)指標(biāo)：倒置相差顯微鏡下觀察HK-2細(xì)胞生長(zhǎng)情況；激光共聚焦顯微鏡測(cè)HK-2細(xì)胞線粒體膜電位(MM

7、P)變化；免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)HK-2細(xì)胞胞漿內(nèi)促凋亡蛋白Bad、Bax的表達(dá)情況；Western blot測(cè)HK-2細(xì)胞內(nèi)線粒體中CytC,AIF的釋放情況。 (6)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用one-way ANOVA分析，組間比較用LSD法。數(shù)據(jù)均用x±s表示，采用SPSS10.0軟件處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： (1)倒置相差顯微鏡下觀察到對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈類上皮樣扁平多角形，折光性強(qiáng)，細(xì)胞間連

8、接緊密，分裂像多，數(shù)量多。窒息組細(xì)胞生長(zhǎng)減慢，貼壁性差，細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯減少，形態(tài)變?yōu)椴灰?guī)則圓形或橢圓形，折光性減弱，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡，脂滴，顆粒樣物，細(xì)胞間連接松散，并可見較多細(xì)胞碎片。PDTC干預(yù)組較對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量變化不大，形態(tài)變化小，部分細(xì)胞有收縮變圓，細(xì)胞折光性較強(qiáng)。 (2)與正常對(duì)照組(2.96±0.38)相比，窒息組(0.87±0.06)和PDTC干預(yù)組(2.46±0.52)細(xì)胞線粒體膜紅/綠熒光強(qiáng)度比值(590/

9、530nm)明顯降低，差異具有顯著性意義(P<0.01)。但與窒息組相比，PDTC干預(yù)組細(xì)胞線粒體膜紅/綠熒光強(qiáng)度比值明顯升高，差異有顯著性意義(P<0.01)。 (3)用HSCORE系數(shù)作半定量評(píng)分，與正常對(duì)照組[(1.97±0.26)和(1.77±0.11)]相比，窒息組[(2.73±0.20)和(2.44±0.13)]和PDTC干預(yù)組[(2.38±0.13)和(2.17±0.08)]促凋亡蛋白Bad、Bax的表達(dá)均明顯增加

10、，差異具有顯著性意義(P<0.01)；但與窒息組相比，PDTC干預(yù)組促凋亡蛋白Bad、Bax的表達(dá)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 (4)正常組HK-2細(xì)胞的胞漿中不含細(xì)胞色素C，主要存在于線粒體內(nèi)，條帶光密度值分別為(156.5±3.54，179.5±2.12)；窒息組胞漿中細(xì)胞色素C從線粒體漏出較對(duì)照組明顯增加，相應(yīng)的在線粒體內(nèi)表達(dá)減少，條帶光密度值分別為(177.5±3.54，155±4.24)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

11、義(P<0.05)；PDTC干預(yù)組胞漿中細(xì)胞色素C表達(dá)也有所增加，但大部分仍位于線粒體內(nèi)，條帶光密度值分別為(165±4.24，171±5.66)，與窒息組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 (5)正常組HK-2細(xì)胞中AIF主要存在于線粒體內(nèi)，條帶光密度值為(212±4.24)；窒息組HK-2細(xì)胞中AIF從線粒體中漏出，在線粒體內(nèi)基本檢測(cè)不到AIF表達(dá)，條帶光密度值為(128±4.24)；PDTC干預(yù)組較窒息組線粒體內(nèi)AI