新生兒窒息后血清中凋亡蛋白激酶1的變化及臨床意義.pdf

1、研究背景及目的：
　　新生兒窒息（Neonatal asphyxia）是新生兒期最常見的疾病之一。發(fā)生窒息后，如果短時(shí)間內(nèi)沒有恢復(fù)供氧，會(huì)導(dǎo)致新生兒死亡。恢復(fù)供氧后也可能導(dǎo)致二次損傷，出現(xiàn)一系列生化事件的瀑布，從而影響患兒發(fā)育，導(dǎo)致遠(yuǎn)期神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的發(fā)生。后遺癥的嚴(yán)重程度取決于窒息的程度，重度窒息與腦性癱瘓、智力低下及癲癇等疾病有關(guān)，輕度窒息也與兒童時(shí)期出現(xiàn)的注意力缺陷及多動(dòng)癥有關(guān)。上述后遺癥的出現(xiàn)，給家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。

2、目前對于窒息新生兒的預(yù)后判斷缺乏生化指標(biāo)，臨床上對于預(yù)后的判斷通常依賴臨床表現(xiàn)、新生兒神經(jīng)行為評(píng)分（Neonatal Behavioral Neurological Assessment，NBNA）和影像學(xué)檢查，但以上檢查手段使用上均具有一定的局限性，臨床上需要早期、客觀的生化指標(biāo)來評(píng)估窒息新生兒的預(yù)后。
　　新生兒窒息引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷主要是因?yàn)槟X組織缺氧缺血和再灌注損傷。一般認(rèn)為，窒息后中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷分為兩個(gè)階段：第一階

3、段涉及到神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，能量衰竭引起細(xì)胞內(nèi)外離子失衡、細(xì)胞水腫、鈣離子損傷；第二階段發(fā)生于生后數(shù)小時(shí)到數(shù)天，僅涉及神經(jīng)元，稱為遲發(fā)性神經(jīng)元死亡(Delayed neuronal death，DND)，目前認(rèn)為遲發(fā)性神經(jīng)元死亡主要是由于細(xì)胞凋亡途徑引起的。近年來，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的生化標(biāo)志物的研究取得了重大的進(jìn)展，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)凋亡蛋白激酶1（Death Associated Protein Kinases，DAPK1）參與了多種中樞

4、神經(jīng)系統(tǒng)損傷的病理過程，可能成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療靶點(diǎn)。
　　N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-d-aspartate receptor，NMDA）受體是一種離子型谷氨酸受體，具有極為復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)，因?yàn)槠鋵τ阝}離子有較高的通透性使得它在突觸的可塑性和興奮性毒性中起著重要的作用。凋亡相關(guān)蛋白激酶(Death Associated Protein Kinases,DAPK)是一類鈣離子/鈣調(diào)素依賴的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族

5、，DAPK1是 DAPK家族的重要成員，DAPK1主要在不同刺激條件下參與細(xì)胞凋亡過程，DAPK1在正常腦組織中保持磷酸化的無活性狀態(tài)，當(dāng)局部缺氧缺血損害出現(xiàn)后，被迅速的去磷酸化表現(xiàn)出活性狀態(tài)，并與NMDA受體的NR2B亞單位的C-末端結(jié)合，使得NR2B亞單位的1303位絲氨酸磷酸化，進(jìn)而激活離子通道 NR1/NR2B受體通道導(dǎo)致大量鈣離子內(nèi)流，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，大量內(nèi)流的鈣離子激活鈣調(diào)磷酸酶（Calcineurin，CaN），CaN

6、磷酸化DAPK1的pS308導(dǎo)致其活化，引發(fā)細(xì)胞凋亡的“瀑布式”效應(yīng)。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明窒息大鼠大腦表達(dá)DAPK1增加，也有報(bào)道腦梗死患者外周血清DAPK1濃度升高，且將外周血清 DAPK1濃度作為腦梗死溶栓治療療效的評(píng)估手段。但國內(nèi)至今無DAPK1與新生兒窒息相關(guān)的報(bào)道。新生兒窒息引起血腦屏障受損，中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生大量的DAPK1進(jìn)入腦脊液及血液中，其濃度的高低可以反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的程度和預(yù)后。
　　本實(shí)驗(yàn)通過研究新生兒窒息患者

7、外周血清DAPK1濃度與新生兒二十項(xiàng)神經(jīng)行為評(píng)分（NBNA）及頭顱磁共振掃描（MRI）之間的相關(guān)性，探討外周血清D APK1與新生兒窒息的關(guān)系及其在窒息后腦損傷預(yù)后的早期評(píng)估中的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　材料和方法：
　　1．材料
　　研究對象：收集廣東省婦幼保健院新生兒病房收治（含本院出生及轉(zhuǎn)運(yùn)）的足月新生兒窒息病例46例，按Apgar評(píng)分分為輕度窒息組和重度窒息組，其中重度窒息組22例，輕度窒息組24例。另隨機(jī)抽取同時(shí)期

8、廣東省婦幼保健院產(chǎn)科出生的足月無窒息新生兒27例作為對照。排除母親診斷為妊娠糖尿病、高血壓等妊娠合并癥及新生兒早產(chǎn)、畸形、遺傳代謝性疾病、核黃疸等異常的因素。
　　2.實(shí)驗(yàn)方法
　　2.1外周血清DAPK1濃度的測定：所有入組新生兒抽取生后第1天、第3天及第5天靜脈血各2ml，標(biāo)本均不進(jìn)行抗凝劑抗凝處理，室溫放置2h后1000x g離心15分鐘取上清，保留血清600μl分置于Eppendorf管中，在-80℃冰箱保存待檢，溶

9、血標(biāo)本剔除。采用美國R&D公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫試劑盒，匯松科技生產(chǎn)的MB530型酶標(biāo)儀，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測外周血清DAPK1濃度。
　　2.2新生兒神經(jīng)行為評(píng)分：所有入組新生兒于生后7天內(nèi)行新生兒二十項(xiàng)神經(jīng)行為評(píng)分（NBNA）評(píng)估。在半暗光線下及安靜的環(huán)境中進(jìn)行，將患兒單獨(dú)放置在上述環(huán)境中安靜30分鐘后測試，由兩次進(jìn)食中間睡眠狀態(tài)時(shí)開始，室溫控制在24-28℃之間，全部項(xiàng)目的檢查于10分鐘內(nèi)完成，采用鮑氏二十項(xiàng)神經(jīng)行為

10、評(píng)分，滿分為40分，35分以下（含35分）判定為預(yù)后不良。
　　2.3頭顱核磁共振掃描：對46例窒息新生兒在生后2周內(nèi)進(jìn)行頭顱核磁共振掃描。所有患兒均經(jīng)家屬同意并簽署知情同意書，使用美國通用公司（GE）光纖1.5T磁共振儀OpTixMR完成頭顱核磁共振掃描。頭顱磁共振掃描前20-30分鐘內(nèi)給予10％的水合氯醛0.5-1.0ml/kg灌腸或苯巴比妥5mg/kg肌肉注射，常規(guī)做軸位T1WI，T2WI，DWI和SWI像，矢狀位T1WI像

11、。
　　2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行結(jié)果分析，計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間的比較采用t檢驗(yàn)，采用Spearman線性相關(guān)分析對變量間的相關(guān)性進(jìn)行分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1．外周血清DAPK1濃度
　　生后第3天，重度窒息組患兒外周血清DAPK1濃度顯著高于輕度窒息組及對照組（248.98±31.65，161.36±25.61，79.92±

12、11.01，P值均＜0.01），輕度窒息組外周血清DAPK1濃度顯著高于對照組（161.36±25.61，79.92±11.01，P＜0.01）；重度窒息組生后第5天外周血清DAPK1濃度顯著高于生后第3天（278.35±41.23，248.98±31.65，P＜0.01），輕度窒息組生后第5天外周血清DAPK1濃度顯著低于生后第3天（127.46±21.19，161.36±25.61，P＜0.01）；各組在生后第1天外周血清DAPK1

13、濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(75.41±10.64，77.07±10.98，80.01±8.65，P值均＞0.05)；對照組在生后第1天、第3天、第5天外周血清DAPK1濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(75.41±10.64，79.92±11.01，72.98±13.24，P值均＞0.05)。
　　2．外周血清DAPK1濃度與NBNA評(píng)分之間的關(guān)系
　　窒息組NBNA評(píng)分顯著低于對照組（34.57±1.34，37.93±1.07，P＜0.01），窒

14、息組外周血清DAPK1濃度與NBNA評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.61，P＜0.01）。NBNA評(píng)分低于35分的患兒生后第3天外周血清DAPK1濃度顯著高于NBNA評(píng)分高于35分的新生兒（228.72±28.34,166.61±23.24，P＜0.01）。
　　3．外周血清DAPK1濃度與頭顱核磁共振掃描結(jié)果之間的關(guān)系
　　46例窒息新生兒生后2周內(nèi)頭顱MRI病灶檢出率為69.6%，頭顱MRI異常組外周血清DAPK1濃度顯著高于M

15、RI正常組（t=3.96，P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1．外周血清 DAPK1水平與新生兒窒息的程度有相關(guān)性并且與窒息程度呈正相關(guān)。
　　2.外周血清DAPK1水平與窒息新生兒NBNA評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。
　　3.外周血清 DAPK1水平與窒息新生兒頭顱 MRI掃描結(jié)果有相關(guān)性，提示DAPK1是新生兒窒息后判斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷有價(jià)值的生化標(biāo)志物。
　　4．外周血清 DAPK1濃度可以作為一項(xiàng)早期、特異性的生