氧化苦參堿對人臍靜脈平滑肌細(xì)胞鈣化的影響及其可能機(jī)制.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)在成功復(fù)制出人臍靜脈平滑肌細(xì)胞(human umbilical vein smooth muscle cells, HUVSMCs)鈣化模型的基礎(chǔ)上，以氧化苦參堿（oxymatrine, OMT）進(jìn)行干預(yù)，觀察OMT對HUVSMCs鈣化的影響，并探討OMT抑制或延緩HUVSMCs鈣化的作用機(jī)制。
　　方法：在采用β-甘油磷酸鹽復(fù)制HUVSMCs鈣化模型的同時(shí)，選擇不同濃度 OMT進(jìn)行干預(yù)：隨機(jī)分為對照組（CON）、鈣化

2、組(CAL)、單純 OMT組、OMT低、中、高濃度干預(yù)組：OMT L、OMT M、OMT H組（在鈣化培養(yǎng)液中分別加入10-6、10-4、10-2 mol/L的OMT）。檢測方法：①HUVSMCs的鑒定：雙目倒置相差顯微鏡下直接觀察HUVSMCs；用抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（抗α-actin）對第2代HUVSMCs進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。②HUVSMCs的Von Kossa染色，觀察各組 HUVSMCs鈣沉積情況。③顯微圖像分析系統(tǒng)定量計(jì)算各

3、組HUVSMCsVon Kossa染色鈣化陽性細(xì)胞百分比。④磷酸苯二鈉法測定HUVSMCs內(nèi)堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）含量的變化。⑤甲基百里香酚藍(lán)比色法測定各組 HUVSMCs鈣含量，判斷鈣化程度。⑥酶聯(lián)免疫吸附法檢測HUVSMCs培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factorβ1, TGFβ1)活性的變化。⑦Western blot法檢測骨保護(hù)素(osteoprot

4、egerin, OPG)、骨保護(hù)素的受體即核因子kB受體活化因子配體(ligand receptor activator of nuclear factor kappa B, RANKL)蛋白含量的變化。⑧放射免疫技術(shù)檢測 HUVSMCs培養(yǎng)液中骨鈣素（osteocaclcin, OC)含量的變化。
　　結(jié)果：①HUVSMCs鈣化模型復(fù)制成功：CAL組與CON組相比，Von Kossa染色顯示 HUVSMCs聚集生長，棕褐色鈣化結(jié)

5、節(jié)明顯增加，鈣化陽性細(xì)胞百分比、細(xì)胞鈣含量、ALP活性均明顯增加(分別 P<0.05)。②OMT可抑制或延緩HUVSMCs的鈣化：OMT干預(yù)組與CAL組相比，Von Kossa染色顯示HUVSMCs聚集生長明顯減輕，棕褐色鈣化結(jié)節(jié)明顯減少，鈣化陽性細(xì)胞百分比、細(xì)胞鈣含量、ALP活性均明顯降低(分別P<0.05)。③OMT抑制HUVSMCs鈣化的可能機(jī)制：OMT低、中、高干預(yù)組與CAL組相比：TGFβ1水平、OC含量均明顯減少(分別 P<