DMT1小分子抑制物ebselen對鐵誘導tau蛋白磷酸化的拮抗作用.pdf

1、前言：
　　 近年來,隨著人口老齡化的社會進展,神經(jīng)退行性疾病越來越受到人們的關注。阿爾茨海默病(Alzheilner's disease,AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性退行性疾病,是老年癡呆中最常見的類型,其主要的病理特征是:(1)在神經(jīng)元外,β淀粉樣蛋白(β-amyloidpeptides,Aβ)沉積形成老年斑(senile plaque,SP);(2)在神經(jīng)元內,tau蛋白異常磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(neuro fib

2、rillary tangles,NFT);(3)神經(jīng)元的丟失等。AD發(fā)病機制復雜,至今尚未完全清楚。
　　 許多研究證實,腦內金屬離子代謝的異常參與AD的病理過程。在AD患者腦內可觀察到過量的鐵離子在SP和NFT內聚集,以及鐵離子誘導的氧化應激。在AD病理生理過程中,鐵離子的異常增高主要有兩方面作用:一方面,鐵離子的聚集直接導致金屬催化蛋白質氧化分子的破壞和有絲分裂信號的異常;另一方面,鐵離子增高促進Aβ的產(chǎn)生、沉積和級聯(lián)反應,

3、同時也促進磷酸化tau蛋白的聚集。由于鐵離子和多種代謝過程有著密切聯(lián)系,所以,腦鐵代謝失調能夠對神經(jīng)功能產(chǎn)生不利的影響。
　　 哺乳動物細胞轉運鐵有兩種途徑:一種是通過轉鐵蛋白(trans ferrin,Tf)—轉鐵蛋白受體(trans ferrinreceptor,TfR)途徑;另一種是通過非轉鐵蛋白結合鐵(non-transferrin-boundiron,NTBI)途徑。非轉鐵蛋白結合鐵(NTBI)途徑主要是通過二價金屬轉

4、運體1(divalentmetaltransporter1,DMT1)將鐵離子轉運至細胞內。DMT1對二價金屬離子Fe2+,Zn2+,Mn2+,Co2+,Cd2+,Cu2+,Ni2+和Pb2+的運輸都具有活性,尤以轉運二價鐵離子為主。DMT1是一個質子金屬離子轉運蛋白,在神經(jīng)元細胞膜均有表達。DMT1有12個跨膜結構域,能夠將外環(huán)境的二價金屬離子向細胞內轉運。發(fā)生在mk小鼠和Belgrade大鼠DMT1基因的G185R位點自發(fā)突變,引起

5、鐵離子吸收障礙,造成小細胞低色素性貧血。DMT1這種突變導致的鐵離子運輸障礙,能對1-甲基4苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)誘導的多巴胺能神經(jīng)元死亡產(chǎn)生保護作用。近年來,我們已經(jīng)報道,DMT1在APP/PS1轉基因鼠腦內表達上調,并且,體外實驗結果顯示,DMT1基因沉默能減少鐵的內流,進而抑制淀粉樣過程和Aβ的分泌?？傊?DMT1成為治療AD的潛在目標。
　　 ebselen(中文名字,依布硒林,也稱為PZ51,英文名

6、2-phenyl-1,2-benzisosenazol-3(2H)one,分子式C13H9NOSe,分子量274.28)是一種脂質水溶性低分子量硒基有機化合物,具有抗氧化活性和抗炎性。特別重要的是,大量證據(jù)證實,ebselen具有神經(jīng)保護作用,目前還處于臨床前期研究階段,而且,近年來已有報道顯示,ebselen是DMT1運輸鐵離子的抑制劑。因此,我們推測ebselen可能通過抑制DMT1運輸鐵離子作用,而成為潛在的抑制鐵誘導tau蛋白磷

7、酸化的抑制劑。在本研究中,以人類神經(jīng)母細胞瘤(humanneuroblastoma)SH-SY5Y細胞作為體外研究對象,給予ebselen處理,對tau蛋白磷酸化和相關信號通路進行評估。
　　 實驗材料和方法：
　　 SH-SY5Y細胞培養(yǎng),待細胞進入生長期按如下分組處理:對照組——未加處理因素,換無血清DMEM培養(yǎng)液;FeSO4組——FeSO450μM作用細胞24h;FeSO4+Ebsden組——Ebselen5μM預

8、處理細胞12h,FeSO450μM作用細胞24h:
　　 Ebselen組——Ebselen5μM作用細胞12h。一、Ebselen對鐵誘導的SH-SY5Y細胞tau蛋白磷酸化的影響
　　 1、細胞種植在96孔板,給予不同劑量ebselen和FeSO4處理細胞,用MTT法對細胞活力進行測量。
　　 2、采用WesternBlot檢測各組細胞內tau蛋白磷酸化蛋白表達水平。
　　 3、采用流式細胞分析術,用

9、DHE作為ROS熒光探針測量各組細胞內ROS含量。
　　 4、采用鐵依賴性細胞內Calcein熒光淬滅法分析ebselen預處理SH-SY5Y細胞的二價鐵離子內流。
　　 二、Ebselen對tau蛋白磷酸化相關信號通路的的影響
　　 1、用WesternBlot探測SH-SY5Y細胞中p-CDK5、CDK5、p35和p25蛋白表達水平。
　　 2、用WeternBlot檢測SH-SY5Y細胞中p-GSK

10、3β和GSK3β蛋白表達水平。
　　 實驗結果：
　　 一、Ebselen抑制鐵誘導SH-SY5Y細胞的tau蛋白磷酸化
　　 用MTT法對細胞活力進行分析,從中選擇FeSO4和ebselen最佳的處理濃度,避免實驗進行中細胞的死亡效應。根據(jù)MTT方法篩選,我們選擇FeSO4作用濃度和時間分別是50μM和24h,ebselen作用濃度和時間分別是5μM和12h。為了研究ebsden是否能影響鐵誘導的細胞內tau蛋

11、白磷酸化,本實驗以鐵離子處理的SH-SY5Y細胞作為研究模型,采用WesternBlot方法檢測ebselen預處理鐵誘導的細胞內tau蛋白磷酸化水平。定量分析結果顯示,總tau蛋白水平在各組之間并沒有顯著性改變;與對照組相比,FeSO4組細胞內tau蛋白在磷酸化Thr205、Ser396和Thr231位點顯著升高分別為261.73±9.88%(p＜0.001),233.94±10.33%(p＜0.001)和211.44±26.86%(

12、p＜0.05)。更重要的是,與FeSO4組相比,ebselen預處理后顯著降低tau蛋白磷酸化水平,分別是Thr205位點33.11±5.21%(p＜0.001),Ser396位點44.05±4.44%(p＜0.001)和Thr231位點39.14±2.41%(p＜0.05)。這些數(shù)據(jù)說明,ebselen能抑制鐵誘導SH-SY5Y細胞的tau蛋白磷酸化。
　　 二、Ebselen減少鐵誘導的SH-SY5Y細胞內ROS產(chǎn)生

13、　　 目前已有報道證實,ebselen抗氧化特性具有神經(jīng)保護作用;并且,ROS產(chǎn)生與鐵離子誘導的神經(jīng)毒性密切相關。因此,我們通過檢測SH-SY5Y細胞中ROS含量,觀察ebselen對二價鐵離子誘導的ROS產(chǎn)生的影響。
　　 采用流式細胞分析術分析結果顯示,與對照組相比,FeSO4處理能顯著增加細胞中ROS267.53±38.14%(p＜0.001)的產(chǎn)生;ebselen預處理后較FeSO4組細胞內ROS減少40.99±5.6

14、6%(p＜0.001),提示ebselen降低鐵誘導的SH-SY5Y細胞內ROS產(chǎn)生。
　　 三、Ebselen抑制二價鐵離子的細胞內轉運
　　 為了驗證ROS產(chǎn)生的減少是否是ebselen對DMT1的抑制作用導致,我們用CalceinAM熒光染料來衡量SH-SY5Y細胞二價鐵離子的流入。熒光分光光度計測定結果表明,FeSO4對Calcein的熒光淬滅具有時間依賴性。值得注意的是,ebsden處理的細胞熒光淬滅時間與對照

15、組細胞比較顯著延遲,給予二價鐵離子螫合劑BIP能逆轉這種FeSO4引起的熒光淬滅,表明ebsden處理導致細胞中的二價鐵離子吸收減少。
　　 四、Ebselen抑制鐵誘導SH-SY5Y細胞內CDK5和GSK3β的活性
　　 為了進一步分析ebselen抑制tau蛋白磷酸化的機制,本實驗對tau蛋白磷酸化相關激酶活性進行檢測。采用免疫印跡方法檢測FeSO4和/或ebselen處理對各組細胞內p-CDK5和CDK5蛋白表達水

16、平的影響。結果顯示,各組細胞內CDK5蛋白質水平未發(fā)生顯著變化:與對照組相比,FeSO4組細胞內p-CDK5/CDK5比值顯著增高220.19±31.10%(p＜0.01),給予ebselen預處理后較FeSO4組細胞內p-CDK5/CDK5比值降低41.58±8.30%(p＜0.001)。
　　 另據(jù)報道,p35裂解p25片段導致CDK5活性異常,引起tau高度磷酸化。因此,我們又對FeSO4和或ebselen處理的SH-SY

17、SY細胞內p35和p25的表達水平進行了檢測。免疫印跡結果顯示,FeSO4和或ebselen處理未改變細胞內p35水平。但是,與對照組相比,FeSO4組細胞內p25/p35比值顯著增加(263.28±22.51%)(p＜0.001),ebselen預處理能顯著降低FeSO4引起的細胞內p25/p35比值(p＜0.001)的增加。
　　 此外,我們用免疫印跡方法對tau蛋白重要的磷酸化激酶GSK3β活性也進行了檢測。結果顯示,各組

18、細胞內GSK3β未發(fā)生顯著變化。但是,與對照組相比,FeSO4處理組細胞內p-GSK3β(Ser9)/GSK3β比值顯著降低,給予ebselen預處理后p-GSK3β(Ser9)/GSK3β水平增加了322.99±53.79%(p＜0.001)。以上這些數(shù)據(jù)表明,ebselen能夠抑制二價鐵離子誘導的SH-SY5Y細胞內CDK5和GSK3β活性。
　　 結論：
　　 1、Ebselen通過抑制DMT1對二價鐵離子的細胞內