DMT1小分子抑制物ebselen對(duì)鐵誘導(dǎo)tau蛋白磷酸化的拮抗作用.pdf

1、前言：
　　 近年來,隨著人口老齡化的社會(huì)進(jìn)展,神經(jīng)退行性疾病越來越受到人們的關(guān)注。阿爾茨海默病(Alzheilner's disease,AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性退行性疾病,是老年癡呆中最常見的類型,其主要的病理特征是:(1)在神經(jīng)元外,β淀粉樣蛋白(β-amyloidpeptides,Aβ)沉積形成老年斑(senile plaque,SP);(2)在神經(jīng)元內(nèi),tau蛋白異常磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neuro fib

2、rillary tangles,NFT);(3)神經(jīng)元的丟失等。AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,至今尚未完全清楚。
　　 許多研究證實(shí),腦內(nèi)金屬離子代謝的異常參與AD的病理過程。在AD患者腦內(nèi)可觀察到過量的鐵離子在SP和NFT內(nèi)聚集,以及鐵離子誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。在AD病理生理過程中,鐵離子的異常增高主要有兩方面作用:一方面,鐵離子的聚集直接導(dǎo)致金屬催化蛋白質(zhì)氧化分子的破壞和有絲分裂信號(hào)的異常;另一方面,鐵離子增高促進(jìn)Aβ的產(chǎn)生、沉積和級(jí)聯(lián)反應(yīng),

3、同時(shí)也促進(jìn)磷酸化tau蛋白的聚集。由于鐵離子和多種代謝過程有著密切聯(lián)系,所以,腦鐵代謝失調(diào)能夠?qū)ι窠?jīng)功能產(chǎn)生不利的影響。
　　 哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)鐵有兩種途徑:一種是通過轉(zhuǎn)鐵蛋白(trans ferrin,Tf)—轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(trans ferrinreceptor,TfR)途徑;另一種是通過非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵(non-transferrin-boundiron,NTBI)途徑。非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵(NTBI)途徑主要是通過二價(jià)金屬轉(zhuǎn)

4、運(yùn)體1(divalentmetaltransporter1,DMT1)將鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。DMT1對(duì)二價(jià)金屬離子Fe2+,Zn2+,Mn2+,Co2+,Cd2+,Cu2+,Ni2+和Pb2+的運(yùn)輸都具有活性,尤以轉(zhuǎn)運(yùn)二價(jià)鐵離子為主。DMT1是一個(gè)質(zhì)子金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,在神經(jīng)元細(xì)胞膜均有表達(dá)。DMT1有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,能夠?qū)⑼猸h(huán)境的二價(jià)金屬離子向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。發(fā)生在mk小鼠和Belgrade大鼠DMT1基因的G185R位點(diǎn)自發(fā)突變,引起

5、鐵離子吸收障礙,造成小細(xì)胞低色素性貧血。DMT1這種突變導(dǎo)致的鐵離子運(yùn)輸障礙,能對(duì)1-甲基4苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元死亡產(chǎn)生保護(hù)作用。近年來,我們已經(jīng)報(bào)道,DMT1在APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)表達(dá)上調(diào),并且,體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,DMT1基因沉默能減少鐵的內(nèi)流,進(jìn)而抑制淀粉樣過程和Aβ的分泌。總之,DMT1成為治療AD的潛在目標(biāo)。
　　 ebselen(中文名字,依布硒林,也稱為PZ51,英文名

6、2-phenyl-1,2-benzisosenazol-3(2H)one,分子式C13H9NOSe,分子量274.28)是一種脂質(zhì)水溶性低分子量硒基有機(jī)化合物,具有抗氧化活性和抗炎性。特別重要的是,大量證據(jù)證實(shí),ebselen具有神經(jīng)保護(hù)作用,目前還處于臨床前期研究階段,而且,近年來已有報(bào)道顯示,ebselen是DMT1運(yùn)輸鐵離子的抑制劑。因此,我們推測(cè)ebselen可能通過抑制DMT1運(yùn)輸鐵離子作用,而成為潛在的抑制鐵誘導(dǎo)tau蛋白磷

7、酸化的抑制劑。在本研究中,以人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤(humanneuroblastoma)SH-SY5Y細(xì)胞作為體外研究對(duì)象,給予ebselen處理,對(duì)tau蛋白磷酸化和相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行評(píng)估。
　　 實(shí)驗(yàn)材料和方法：
　　 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng),待細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)期按如下分組處理:對(duì)照組——未加處理因素,換無血清DMEM培養(yǎng)液;FeSO4組——FeSO450μM作用細(xì)胞24h;FeSO4+Ebsden組——Ebselen5μM預(yù)

8、處理細(xì)胞12h,FeSO450μM作用細(xì)胞24h:
　　 Ebselen組——Ebselen5μM作用細(xì)胞12h。一、Ebselen對(duì)鐵誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞tau蛋白磷酸化的影響
　　 1、細(xì)胞種植在96孔板,給予不同劑量ebselen和FeSO4處理細(xì)胞,用MTT法對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行測(cè)量。
　　 2、采用WesternBlot檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)tau蛋白磷酸化蛋白表達(dá)水平。
　　 3、采用流式細(xì)胞分析術(shù),用

9、DHE作為ROS熒光探針測(cè)量各組細(xì)胞內(nèi)ROS含量。
　　 4、采用鐵依賴性細(xì)胞內(nèi)Calcein熒光淬滅法分析ebselen預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞的二價(jià)鐵離子內(nèi)流。
　　 二、Ebselen對(duì)tau蛋白磷酸化相關(guān)信號(hào)通路的的影響
　　 1、用WesternBlot探測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞中p-CDK5、CDK5、p35和p25蛋白表達(dá)水平。
　　 2、用WeternBlot檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞中p-GSK

10、3β和GSK3β蛋白表達(dá)水平。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 一、Ebselen抑制鐵誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的tau蛋白磷酸化
　　 用MTT法對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行分析,從中選擇FeSO4和ebselen最佳的處理濃度,避免實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中細(xì)胞的死亡效應(yīng)。根據(jù)MTT方法篩選,我們選擇FeSO4作用濃度和時(shí)間分別是50μM和24h,ebselen作用濃度和時(shí)間分別是5μM和12h。為了研究ebsden是否能影響鐵誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)tau蛋

11、白磷酸化,本實(shí)驗(yàn)以鐵離子處理的SH-SY5Y細(xì)胞作為研究模型,采用WesternBlot方法檢測(cè)ebselen預(yù)處理鐵誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)tau蛋白磷酸化水平。定量分析結(jié)果顯示,總tau蛋白水平在各組之間并沒有顯著性改變;與對(duì)照組相比,FeSO4組細(xì)胞內(nèi)tau蛋白在磷酸化Thr205、Ser396和Thr231位點(diǎn)顯著升高分別為261.73±9.88%(p＜0.001),233.94±10.33%(p＜0.001)和211.44±26.86%(

12、p＜0.05)。更重要的是,與FeSO4組相比,ebselen預(yù)處理后顯著降低tau蛋白磷酸化水平,分別是Thr205位點(diǎn)33.11±5.21%(p＜0.001),Ser396位點(diǎn)44.05±4.44%(p＜0.001)和Thr231位點(diǎn)39.14±2.41%(p＜0.05)。這些數(shù)據(jù)說明,ebselen能抑制鐵誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的tau蛋白磷酸化。
　　 二、Ebselen減少鐵誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生

13、　　 目前已有報(bào)道證實(shí),ebselen抗氧化特性具有神經(jīng)保護(hù)作用;并且,ROS產(chǎn)生與鐵離子誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性密切相關(guān)。因此,我們通過檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞中ROS含量,觀察ebselen對(duì)二價(jià)鐵離子誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生的影響。
　　 采用流式細(xì)胞分析術(shù)分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,FeSO4處理能顯著增加細(xì)胞中ROS267.53±38.14%(p＜0.001)的產(chǎn)生;ebselen預(yù)處理后較FeSO4組細(xì)胞內(nèi)ROS減少40.99±5.6

14、6%(p＜0.001),提示ebselen降低鐵誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生。
　　 三、Ebselen抑制二價(jià)鐵離子的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)
　　 為了驗(yàn)證ROS產(chǎn)生的減少是否是ebselen對(duì)DMT1的抑制作用導(dǎo)致,我們用CalceinAM熒光染料來衡量SH-SY5Y細(xì)胞二價(jià)鐵離子的流入。熒光分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果表明,FeSO4對(duì)Calcein的熒光淬滅具有時(shí)間依賴性。值得注意的是,ebsden處理的細(xì)胞熒光淬滅時(shí)間與對(duì)照

15、組細(xì)胞比較顯著延遲,給予二價(jià)鐵離子螫合劑BIP能逆轉(zhuǎn)這種FeSO4引起的熒光淬滅,表明ebsden處理導(dǎo)致細(xì)胞中的二價(jià)鐵離子吸收減少。
　　 四、Ebselen抑制鐵誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)CDK5和GSK3β的活性
　　 為了進(jìn)一步分析ebselen抑制tau蛋白磷酸化的機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)對(duì)tau蛋白磷酸化相關(guān)激酶活性進(jìn)行檢測(cè)。采用免疫印跡方法檢測(cè)FeSO4和/或ebselen處理對(duì)各組細(xì)胞內(nèi)p-CDK5和CDK5蛋白表達(dá)水

16、平的影響。結(jié)果顯示,各組細(xì)胞內(nèi)CDK5蛋白質(zhì)水平未發(fā)生顯著變化:與對(duì)照組相比,FeSO4組細(xì)胞內(nèi)p-CDK5/CDK5比值顯著增高220.19±31.10%(p＜0.01),給予ebselen預(yù)處理后較FeSO4組細(xì)胞內(nèi)p-CDK5/CDK5比值降低41.58±8.30%(p＜0.001)。
　　 另?yè)?jù)報(bào)道,p35裂解p25片段導(dǎo)致CDK5活性異常,引起tau高度磷酸化。因此,我們又對(duì)FeSO4和或ebselen處理的SH-SY

17、SY細(xì)胞內(nèi)p35和p25的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。免疫印跡結(jié)果顯示,FeSO4和或ebselen處理未改變細(xì)胞內(nèi)p35水平。但是,與對(duì)照組相比,FeSO4組細(xì)胞內(nèi)p25/p35比值顯著增加(263.28±22.51%)(p＜0.001),ebselen預(yù)處理能顯著降低FeSO4引起的細(xì)胞內(nèi)p25/p35比值(p＜0.001)的增加。
　　 此外,我們用免疫印跡方法對(duì)tau蛋白重要的磷酸化激酶GSK3β活性也進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示,各組

18、細(xì)胞內(nèi)GSK3β未發(fā)生顯著變化。但是,與對(duì)照組相比,FeSO4處理組細(xì)胞內(nèi)p-GSK3β(Ser9)/GSK3β比值顯著降低,給予ebselen預(yù)處理后p-GSK3β(Ser9)/GSK3β水平增加了322.99±53.79%(p＜0.001)。以上這些數(shù)據(jù)表明,ebselen能夠抑制二價(jià)鐵離子誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)CDK5和GSK3β活性。
　　 結(jié)論：
　　 1、Ebselen通過抑制DMT1對(duì)二價(jià)鐵離子的細(xì)胞內(nèi)