先天性甲狀腺功能減低仔鼠心肌細(xì)胞縫隙連接蛋白43和45的表達(dá)變化.pdf

1、目的：
　　 甲狀腺激素(TH)對(duì)許多器官的發(fā)育和分化起到關(guān)鍵性作用。先天性甲狀腺功能減低癥(先天性甲低)是兒科常見的內(nèi)分泌代謝性疾病之一，是造成兒童智力障礙的重要原因之一。此外，該疾病還常伴發(fā)許多器官功能障礙。如伴發(fā)心臟疾病，包括異常胎心率、先天性心臟疾病、心臟傳導(dǎo)阻滯、心律失常，甚至是心室功能受損。有研究報(bào)道左旋甲狀腺激素的替代治療可改善心律失常和心室功能，甚至能促進(jìn)動(dòng)脈導(dǎo)管關(guān)閉。
　　 先天性甲低患兒伴發(fā)心臟異常的

2、發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚。TH在細(xì)胞核內(nèi)與其受體(TR)結(jié)合，作用于靶基因啟動(dòng)子的甲狀腺激素反應(yīng)元件(TREs)，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。有些研究報(bào)道先天性甲低可影響心臟上某些基因的表達(dá)，然而甲低具體通過影響哪些基因?qū)е滦呐K發(fā)育異常目前仍不明確。
　　 縫隙連接(GJ)是一種細(xì)胞間連接方式，是相鄰細(xì)胞間物質(zhì)和信息直接交換的膜通道結(jié)構(gòu)。GJ由相鄰胞膜上的一對(duì)連接子構(gòu)成，每個(gè)連接子包含6個(gè)縫隙連接蛋白(Cx)亞單位，構(gòu)成一個(gè)直徑

3、約1.5nm的親水孔道.相鄰細(xì)胞間通過GJ介導(dǎo)的連接通訊(GJIC)進(jìn)行信息、能量和物質(zhì)的交換，從而對(duì)細(xì)胞的新陳代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，以及細(xì)胞的增殖、分化和胚胎發(fā)育等生理過程起到重要的調(diào)控作用。Cx廣泛存在于哺乳動(dòng)物的心臟中，包括Cx43，Cx45和Cx40等。Cx43是Cx家族中數(shù)量最豐富的成員，占到總數(shù)的90～95％，也是哺乳動(dòng)物心臟中最主要的Cx。這些Cx對(duì)心臟的正常發(fā)育和生理功能具有重要的作用。他們調(diào)解電沖動(dòng)的傳播速度，觸發(fā)心肌細(xì)胞

4、和協(xié)調(diào)動(dòng)脈壁細(xì)胞同步收縮。關(guān)于TH增高是否會(huì)影響心肌細(xì)胞上Cx43的表達(dá)仍有較多爭(zhēng)議。目前，先天性甲低情況下Cx43和Cx45的表達(dá)尚無相關(guān)的研究報(bào)道。
　　 在此，我們通過建立先天性甲低的小鼠模型，檢測(cè)先天性甲低對(duì)心室肌細(xì)胞Cx43和Cx45表達(dá)的影響，以進(jìn)一步了解TH對(duì)Cx表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，為深入研究先天性甲低伴發(fā)心臟疾病的發(fā)病機(jī)制和保護(hù)干預(yù)措施等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.模型建立和分組
　

5、　 清潔級(jí)健康成年C57BL/6J小鼠合籠交配后自行產(chǎn)子，按處理?xiàng)l件不同分甲低組和對(duì)照組。
　　 甲低組：合籠第10天開始給予母鼠含0.03％甲巰咪唑的飲用水，一直到仔鼠出生7天后。
　　 對(duì)照組：一直喂養(yǎng)清潔飲用水，其它實(shí)驗(yàn)控制因素同甲低組。
　　 在仔鼠出生1、7和14天麻醉后處死，生理鹽水灌注，留取心室標(biāo)本。
　　 2.Realtime-PCR檢測(cè)(RT-PCR檢測(cè))
　　 采用RT-PC

6、R檢測(cè)Cx43和Cx45的mRNA水平。采用AxyPrep總RNA小量制備試劑盒提取左心室組織總RNA，采用自行設(shè)計(jì)引物和Takara熒光PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用兩步法檢測(cè)Cx43和Cx45。熱循環(huán)包括94℃預(yù)變性3分鐘，94℃變性15秒和63℃復(fù)性35秒，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后，熔解曲線分析檢測(cè)擴(kuò)增子的正確性。目的基因mRNA水平采用△Ct表示，并應(yīng)用△Ct進(jìn)行組間比較，△Ct=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參)，△Ct越小表明mR

7、NA水平越高。設(shè)陰性對(duì)照。
　　 3.免疫組化
　　 新鮮心室組織予10％中性福爾馬林固定和石蠟包埋，冠狀連續(xù)系列切片，片厚4μm，采用“ChemMateTM和DakoEnVisonTM兩步法”進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。兔Cx43抗體購(gòu)于美國(guó)LavisionNeo-Markers公司。兔Cx45抗體購(gòu)于美國(guó)SantaCruzBiotechnologyInc。羊抗鼠或抗兔的IgG二抗購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司(江蘇)。
　　

8、免疫組化測(cè)量：每組6個(gè)標(biāo)本，在相同光線背景下，在顯微鏡200倍視野下每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選擇1個(gè)染色陽性區(qū)域(大小為461.944μm×345.328μm)，用Image-ProPlus5.0圖像分析軟件測(cè)量該區(qū)域的陽性表達(dá)積分光密度值(IntegratedOpticalDensity，IOD)，取平均值代表該組的蛋白顆粒密度，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。
　　 4.統(tǒng)計(jì)分析
　　 應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件(10.0)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

9、計(jì)數(shù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，兩組間差異應(yīng)用t檢驗(yàn)，多組組間差異應(yīng)用單因素方差分析(One-WayANOVA)，繼以LSD法兩兩比較.采用雙側(cè)性檢測(cè)，P<0.05認(rèn)為差異有顯著性意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.模型檢驗(yàn)
　　 7天和14天日齡仔鼠處死前留血進(jìn)行甲狀腺激素水平檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)甲低組總T4和游離T4均較對(duì)照組降低，差異具有顯著性意義(均P<0.001)。
　　 2.先天性甲低對(duì)Cx43和Cx45表達(dá)的影響

10、
　　 對(duì)照組心室肌細(xì)胞Cx43△Ct出生后增加，生后7天達(dá)高峰，然后有所降低，提示出生后心肌細(xì)胞上Cx43mRNA水平較低，出生7天后開始升高。
　　 甲低組心室肌細(xì)胞Cx43△Ct出生后增加，但出生7天后仍在增加，意味著出生后心肌細(xì)胞上Cx43mRNA水平持續(xù)減低.與對(duì)照組比較，甲減組的Cx43△Ct在生后7和14天均明顯升高(均P<0.001)，表示甲減組生后7和14天時(shí)Cx43mRNA水平明顯減低。免疫組化顯示兩

11、組的心室肌閏盤都存在豐富的Cx43蛋白。與對(duì)照組比較甲減組Cx43免疫陽性較低。
　　 兩組的Cx45的△Ct出生后都呈下降趨勢(shì)，各組的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)間差異具有顯著性意義(均P<0.001)，提示兩組仔鼠出生后心肌細(xì)胞的Cx45mRNA水平呈增加趨勢(shì)。
　　 與對(duì)照組比較，甲減組Cx45的△Ct稍高，但2組間的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，差異均無顯著性意義(均P>0.05)，提示兩組間Cx45mRNA水平無顯著性差異。免疫組化顯示兩組的