心肌縫隙連接蛋白43與失血性休克-復蘇致兔心肌細胞凋亡的關系.pdf

1、目的:失血性休克是臨床常見的危急重癥，多見于外科大血管破裂，腹部損傷引起的肝、脾破裂，消化性潰瘍出血及婦產(chǎn)科疾病等，采取積極、有效地處理措施將影響病人的預后。失血性休克的病理生理主要表現(xiàn)為全身缺血/缺氧性損傷，當血容量不足失代償時可導致多臟器功能障礙；復蘇后甚至加重臟器受損表現(xiàn)為不可逆性損傷，有學者將失血性休克/復蘇（HS/R）視為全身性缺血再灌注損傷。心肌耐受缺血缺氧能力較強，但機體急劇大量失血及失代償時仍表現(xiàn)出心功能降低，進一步加重

2、缺血臟器灌注不足；復蘇后誘發(fā)心臟缺血再灌注損傷，影響體循環(huán)血流動力學，不利于預后[1]。心肌縫隙連接(gapjunction，GJ)是存在心肌細胞間重要的通訊方式，主要由縫隙連接蛋白43(connexin43，Cx43)構(gòu)成。GJ特點是低電阻，實現(xiàn)了相鄰細胞間的電耦聯(lián)及化學信息交換[2]。GJ通訊受病理生理和藥物因素等影響[3,4]。Cx43蛋白的表達、磷酸化狀態(tài)和分布與GJ通訊功能有著緊密聯(lián)系[5]。有研究表明，失血前預先給予GJ通道

3、阻滯劑庚醇對缺血心肌產(chǎn)生保護作用[6]。急性心肌缺血時心肌細胞Cx43表達及分布發(fā)生變化，可調(diào)控細胞生命周期及細胞存亡，然而Cx43蛋白與心肌細胞凋亡的關系，有待加深研究。本課題擬采用新西蘭白兔失血性休克復蘇模型，探討失血性休克及復蘇致兔心肌損傷時心肌Cx43變化，分析心肌Cx43與心肌細胞凋亡的關系。
　　方法:健康成年雄性新西蘭白兔32只，月齡5~7月，體重2.5~3.0kg，采用隨機數(shù)字表法，將其分為4組(n=8)：假手術(shù)組

4、(S組)、失血性休克復蘇組(HSR組)、庚醇干預組(HP組)、有機溶劑二甲基亞砜組(DMSO組)。
　　取兔稱重后經(jīng)耳緣靜脈按30mg/kg注射3％戊巴比妥鈉麻醉，麻醉后固定在兔臺，按改良的Wigger’s法制作失血性休克動物模型，休克前30min時HP組經(jīng)耳緣靜脈緩慢注入庚醇（溶于二甲基亞砜有機溶劑）0.6mg/kg，HSR組及S組給予等容量生理鹽水，DMSO組給予等容量的DMSO溶液，給藥30min后通過左側(cè)股動脈放血,10m

5、in內(nèi)使MAP降至40mmHg(1mmHg=0.133kPa)，通過放血或回輸放出血液，維持MAP35~45mmHg，并持續(xù)60min。然后在20~25min內(nèi)回輸全部失血及等容生理鹽水，進行復蘇，MAP恢復至基礎水平的90％，維持此水平，觀察60min。于放血前(T0)、休克30min(T1)、休克60min(T2)、復蘇30min(T3)、復蘇60min(T4)5個時間點，分別取動脈血樣2ml，3500轉(zhuǎn)/min，離心半徑10cm，

6、4℃離心15min，分離血漿，取血漿0.2~0.4ml，-20℃保存；復蘇60min取完血樣后開胸，取心尖部心肌組織，一分為二，一半用4％多聚甲醛溶液固定待測，另一半置于EP管中液氮凍存24h，再轉(zhuǎn)?80oC冰箱保存待測。
　　采用ELISA法檢測血漿cTnI濃度；4%多聚甲醛溶液固定的心肌組織常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片及HE染色，光鏡下觀察病理學結(jié)果；采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)測定心肌細胞凋亡情況、

7、計算凋亡指數(shù)(AI)；?80℃冰箱凍存的心肌組織用于Westernblot法檢測兔心肌組織中Cx43蛋白表達水平。
　　結(jié)果:1各組兔心肌組織病理學變化S組兔心肌細胞形態(tài)正常，呈橢圓形或短梭形，心肌纖維排列整齊、緊密，細胞核染色均勻，核膜完整；HSR組、DMSO組心肌細胞肥大腫脹，心肌纖維排列不規(guī)則，出現(xiàn)斷裂，結(jié)構(gòu)紊亂，可見細胞核深染、固縮現(xiàn)象，心肌纖維間隙增寬，間質(zhì)有大量炎性細胞浸潤；與HSR組比較，DMSO組病理性損傷程度無差

8、異；HP組心肌病理性損傷減輕，可見心肌細胞排列規(guī)則，心肌細胞輕度水腫偶見點狀壞死；2各組兔不同時點血漿cTnI濃度的比較與放血前T0時比較，休克30min(T1)、60min(T2)及復蘇30min(T3)、60min(T4)時點S組兔血漿cTnI濃度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，HSR組兔血漿cTnI濃度升高(P<0.05)；與S組比較，HSR組、HP組、DMSO組休克及復蘇后各時點兔血漿cTnI濃度升高(P<0.05)；與HSR

9、組對應時點比較，HP組血漿cTnI濃度降低(P<0.05)，DMSO組上述指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；3各組兔心肌組織中Cx43蛋白表達的比較與S組比較，HSR組、HP組、DMSO組Cx43蛋白表達下調(diào)(P<0.05)；與HSR組比較，DMSO組上述指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，HP組Cx43蛋白表達上調(diào)(P<0.05)；4各組兔心肌細胞凋亡指數(shù)(AI)的比較與S組比較，HSR組、HP組、DMSO組AI升高(P<0.0