縫隙連接蛋白50基因V44A突變致先天性白內(nèi)障的機制研究.pdf

1、研究目的:
　　本研究擬對一先天性特殊表型白內(nèi)障大家系進行疾病相關候選基因的定位及目標基因體外克隆，通過對蛋白定位、縫隙連接半通道功能及縫隙連接通道功能的檢測，探究該突變導致先天性白內(nèi)障發(fā)生的機制。
　　研究方法:
　　基因篩查部分:收集一先天性遺傳性白內(nèi)障家系，所有家族成員接受眼部裂隙燈檢查，抽取外周血樣本，提取基因組DNA。白內(nèi)障術中收集患者前囊膜及晶狀體樣本，制作電鏡標本并觀察晶狀體超微結構改變。聚合酶鏈反應(P

2、CR)擴增與該家系表型相關的候選基因并進行序列分析。以100位健康中國人基因組DNA為陰性對照。根據(jù)上述結果，運用Antheprot4.3和Swiss-model軟件對野生組及突變組蛋白二級結構及三級結構進行分析。
　　基因功能研究部分:從人晶狀體cDNA文庫中獲得GJA8基因，克隆并重組至pEGFP-N1質(zhì)粒中，構建野生型質(zhì)粒Cx50-EGFP。利用定點突變技術，構建突變型質(zhì)粒Cx50V44A-EGFP。野生型質(zhì)粒、突變型質(zhì)粒及

3、空白質(zhì)粒(pEGFP-N1)分別轉染Hek-293細胞，利用G418篩選，獲得穩(wěn)定轉染各組質(zhì)粒的細胞系。在穩(wěn)定轉染細胞中觀察蛋白定位及縫隙連接形成。在低鈣、生理鈣及Connexin通道抑制劑環(huán)境下，運用極性染料染核技術及膜片鉗技術，檢測各組細胞半通道功能區(qū)別。在生理鈣環(huán)境下，利用單細胞注射及染料彌散試驗，檢測各組細胞縫隙連接通道功能區(qū)別。
　　研究結果:
　　該家系患者白內(nèi)障表型為核性混濁，但不累及“Y”字縫，不伴有其他眼部

4、或系統(tǒng)性疾病，遺傳方式為常染色體顯性遺傳?；驕y序發(fā)現(xiàn)該家系患者GJA8基因cDNA第131位堿基胸腺嘧啶轉換為胞嘧啶(c.131 T＞C)，該突變導致GJA8基因所表達Cx50蛋白的44位氨基酸由纈氨酸轉變?yōu)楸彼?p.V44A)，而在家系正常人及100個中國正常漢族人中均未發(fā)現(xiàn)該突變。成功建立穩(wěn)定轉染Cx50-EGFP、Cx50V44A-EGFP、pEGFP-N1質(zhì)粒的Hek293細胞系。在野生組細胞及突變組細胞中皆觀察到縫隙連接的

5、形成，數(shù)量上無統(tǒng)計學差異。在半通道功能檢測中，低鈣環(huán)境下，野生組細胞可攝取DAPI和PI兩種染料，而突變組及空白組細胞不能攝取;而在生理鈣和Cx通道抑制劑環(huán)境下，三組細胞皆不能攝取染料。全細胞膜片鉗檢測發(fā)現(xiàn)低鈣環(huán)境下野生組細胞表面電流顯著高于突變組細胞?？p隙連接通道功能檢測中，4％ neurobiotin可在野生組及突變組細胞中彌散，而5％ Luciferyellow僅在野生組細胞中彌散。
　　研究結論:
　　本研究首次發(fā)現(xiàn)