縫隙連接蛋白50基因V44A突變致先天性白內(nèi)障的機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　本研究擬對(duì)一先天性特殊表型白內(nèi)障大家系進(jìn)行疾病相關(guān)候選基因的定位及目標(biāo)基因體外克隆，通過(guò)對(duì)蛋白定位、縫隙連接半通道功能及縫隙連接通道功能的檢測(cè)，探究該突變導(dǎo)致先天性白內(nèi)障發(fā)生的機(jī)制。
　　研究方法:
　　基因篩查部分:收集一先天性遺傳性白內(nèi)障家系，所有家族成員接受眼部裂隙燈檢查，抽取外周血樣本，提取基因組DNA。白內(nèi)障術(shù)中收集患者前囊膜及晶狀體樣本，制作電鏡標(biāo)本并觀察晶狀體超微結(jié)構(gòu)改變。聚合酶鏈反應(yīng)(P

2、CR)擴(kuò)增與該家系表型相關(guān)的候選基因并進(jìn)行序列分析。以100位健康中國(guó)人基因組DNA為陰性對(duì)照。根據(jù)上述結(jié)果，運(yùn)用Antheprot4.3和Swiss-model軟件對(duì)野生組及突變組蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。
　　基因功能研究部分:從人晶狀體cDNA文庫(kù)中獲得GJA8基因，克隆并重組至pEGFP-N1質(zhì)粒中，構(gòu)建野生型質(zhì)粒Cx50-EGFP。利用定點(diǎn)突變技術(shù)，構(gòu)建突變型質(zhì)粒Cx50V44A-EGFP。野生型質(zhì)粒、突變型質(zhì)粒及

3、空白質(zhì)粒(pEGFP-N1)分別轉(zhuǎn)染Hek-293細(xì)胞，利用G418篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染各組質(zhì)粒的細(xì)胞系。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中觀察蛋白定位及縫隙連接形成。在低鈣、生理鈣及Connexin通道抑制劑環(huán)境下，運(yùn)用極性染料染核技術(shù)及膜片鉗技術(shù)，檢測(cè)各組細(xì)胞半通道功能區(qū)別。在生理鈣環(huán)境下，利用單細(xì)胞注射及染料彌散試驗(yàn)，檢測(cè)各組細(xì)胞縫隙連接通道功能區(qū)別。
　　研究結(jié)果:
　　該家系患者白內(nèi)障表型為核性混濁，但不累及“Y”字縫，不伴有其他眼部

4、或系統(tǒng)性疾病，遺傳方式為常染色體顯性遺傳?；驕y(cè)序發(fā)現(xiàn)該家系患者GJA8基因cDNA第131位堿基胸腺嘧啶轉(zhuǎn)換為胞嘧啶(c.131 T＞C)，該突變導(dǎo)致GJA8基因所表達(dá)Cx50蛋白的44位氨基酸由纈氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼?p.V44A)，而在家系正常人及100個(gè)中國(guó)正常漢族人中均未發(fā)現(xiàn)該突變。成功建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Cx50-EGFP、Cx50V44A-EGFP、pEGFP-N1質(zhì)粒的Hek293細(xì)胞系。在野生組細(xì)胞及突變組細(xì)胞中皆觀察到縫隙連接的

5、形成，數(shù)量上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在半通道功能檢測(cè)中，低鈣環(huán)境下，野生組細(xì)胞可攝取DAPI和PI兩種染料，而突變組及空白組細(xì)胞不能攝取;而在生理鈣和Cx通道抑制劑環(huán)境下，三組細(xì)胞皆不能攝取染料。全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)發(fā)現(xiàn)低鈣環(huán)境下野生組細(xì)胞表面電流顯著高于突變組細(xì)胞。縫隙連接通道功能檢測(cè)中，4％ neurobiotin可在野生組及突變組細(xì)胞中彌散，而5％ Luciferyellow僅在野生組細(xì)胞中彌散。
　　研究結(jié)論:
　　本研究首次發(fā)現(xiàn)